G1/S移行におけるRB蛋白質の役割

RB 蛋白在 G1/S 转变中的作用

• 批准号: 07254215
• 负责人: 田矢 洋一
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07254215/
• 关键词: RB蛋白質; 細胞周期; サイクリンD1; Cdk4; Cdk2; サイクリンE; サイクリンA; p107

RB蛋白質の細胞増殖抑制活性は細胞周期特異的なリン酸化で制御されている。しかし、癌化のメカニズムを考える際に特に重要なGl/S移行期においては、サイクリンD、E、Aをそれぞれ含む少なくとも3種類以上のキナーゼがそのリン酸化に関与すると言われながらも、使い分けの機構などが不明であるので、それを解明することを目的とした。そのために、サイクリンDl/Cdk4、サイクリンE/Cdk2とサイクリンA/Cdk2をそれぞれ精製し、これらの精製キナーゼで多くの種類の合成ペプチドや蛋白質のリン酸化を行い、基質特異性の違いを解析した。一方では、化学合成したリン酸化ペプチドを抗原として、RB蛋白質の特定リン酸化部位のみ認識するモノクローナル抗体の作製を試みた。その結果、サイクリンEやA依存性キナーゼによるリン酸化の共通モチーフはS/T-P-X-K/Rであるが、サイクリンDl/Cdk4のそれは明確に異なり、-2の位置にProを必要とすることがわかった。さらに、RB蛋白質上にはサイクリンDl/Cdk4特異的なリン酸化部位があることを見い出し、その部位を変異させたRB蛋白質も作製した。また、p107がサイクリンDl/Cdk4でリン酸化されることもことも見い出した。一方では、RB蛋白質の807番目のリン酸化セリンを認識するモノクローナル抗体が作製できた。Cdk4特異的なインヒビターであるp16は、多くの癌で失活している癌抑制遺伝子産物でもあるので、p16と同様な活性をもつ低分子物質は癌治療薬になると期待されるが、我々が発見したサイクリンDl/Cdk4の基質特異性は、そうした低分子物質の探索に利用できるはずである。

RB蛋白的细胞增殖抑制活性受细胞周期特异性磷酸化调节。但是，在GL/S转型阶段，在考虑癌症发展的机理时，这一点尤其重要，尽管据说至少三种或更多类型的激酶，每种激酶含有磷酸化，使用机理，使用机理等是未知的，因此目的是阐明这一点。为此，纯化了细胞周期蛋白DL/CDK4，细胞周期蛋白E/CDK2和细胞周期蛋白A/CDK2，并将这些纯化的激酶磷酸化至许多类型的合成肽和蛋白质，并分析了底物特异性的差异。另一方面，我们试图产生一种单克隆抗体，该抗体仅使用化学合成的磷酸化肽作为抗原识别Rb蛋白的特异性磷酸化位点。结果表明，细胞周期蛋白E和A依赖性激酶的磷酸化基序是S/T-P-X-K/R，但细胞周期蛋白DL/CDK4的磷酸化基序明显不同，需要-2位置Pro。此外，发现RB蛋白上有细胞周期蛋白DL/CDK4特异性磷酸化位点，还产生了带有突变位点的RB蛋白。还发现P107被细胞周期蛋白DL/CDK4磷酸化。一方面，产生了一种识别Rb蛋白807处磷酸化丝氨酸的单克隆抗体。由于p16（一种CDK4特异性抑制剂）也是一种癌症抑制基因产物，在许多癌症中无活性，因此预计具有与p16相似活性的小分子将成为癌症治疗，但是Cyclin dl/cdk4的底物特异性应该可以搜索以搜索如此小的分子。

项目成果

Taya, Y.: "Cell cycle-dependent phosphorylation of the tumor suppressor RB protein." Molecules and Cells. 5. 191-195 (1995)

Taya, Y.：“肿瘤抑制 RB 蛋白的细胞周期依赖性磷酸化。”

Sakai, Y. et al.: "cDNA sequence, chromosomal localization of a novel human protein RBQ-1 which binds to the retinoblastoma gene product." Genomics. 30. 98-101 (1995)

Sakai, Y. 等人：“与视网膜母细胞瘤基因产物结合的新型人类蛋白 RBQ-1 的 cDNA 序列和染色体定位。”

Ueno, Y., et al.: "Solid-phase synthesis of peptides containing O-phosphoryl serine and O-phosphoryl threonine using allyl group for phosphate protection." Bioorg. Med. Chem. Let.5. 823-826 (1995)

Ueno, Y. 等人：“使用烯丙基进行磷酸盐保护，固相合成含有 O-磷酰丝氨酸和 O-磷酰苏氨酸的肽。”

Higashi, H. et al.: "Cdk2 forms an inactive complex with cyclin D1 since Cdk2 associated with cyclin D1 is not phosphorylated by Cdk7-cyclin H." Eur. J. Biochem.(in press). (1996)

Higashi, H. 等人：“Cdk2 与细胞周期蛋白 D1 形成无活性复合物，因为与细胞周期蛋白 D1 相关的 Cdk2 不会被 Cdk7-细胞周期蛋白 H 磷酸化。”

Inoue, A. et al.: "70-kDa heat shock cognate protein directly interacts with N-terminal region of the retinoblastoma gene product pRb-identification of a novel region of pRb mediating protein interaction." J. Biol. Chem.270. 22571-22576 (1995)

Inoue, A. 等人：“70-kDa 热休克同源蛋白直接与视网膜母细胞瘤基因产物 pRb 的 N 末端区域相互作用，鉴定了 pRb 介导蛋白质相互作用的新区域。”