RB蛋白質のリン酸化による核内局在性変化の解析

RB蛋白磷酸化引起的核定位变化分析

基本信息

批准号：
08274224
负责人：
田矢洋一
金额：
$ 1.15万
依托单位：
National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08274224/
关键词：
RB蛋白質細胞核 Cdk4 サイクリンD1 Cdk2 サイクリンE

项目摘要

RB蛋白質の細胞増殖抑制能は細胞周期特異的リン酸化で制御されている。一方で、RB蛋白質は何らかの核の構造体と結合していて、その結合もRB蛋白質のリン酸化で制御されているるらしいが、実体は不明である。本研究はその解明を目指した。そして、目的のために、我々が作製した、RB蛋白質のリン酸化サイト特異的抗体を用いることを考えた。その結果、次のような研究成果が得られた。先ず、RB蛋白質のリン酸化を行う酵素について詳細な解析を行った結果、Cdk4-サイクリンD1によるリン酸化の共通モチーフがCdk2-E/Aによるリン酸化のそれとは異なること、さらに、RB蛋白質上の12-13カ所のリン酸化サイトのうち少なくともSer780は、細胞周期において、Cdk4-サイクリンD1によって特異的にリン酸化されることを明らかにした。逆に、Thr356は、Cdk4-サイクリンD1によってはリン酸化されないけれどもCdk2-E/Aによってリン酸化されるサイトらしいことをつきとめつつある。また、我々は、リン酸化されたSer780を含む、13カ所すべての推定リン酸化サイトに対応する抗体を、化合合成したペプチドを抗原として用いて作製した。同調化したT98G細胞で調べると、これらの抗体は、リン酸化RB蛋白質を細胞周期の異なった時期に検出した。さらに、こうしたリン酸化サイト特異的な抗体を用いて、RB蛋白質のどのサイトがリン酸化された時にRB蛋白質が核の構造体から解離するのかを解析中である。

RB 蛋白的细胞抑制能力由细胞周期特异性磷酸化控制。另一方面，RB蛋白与某些核结构结合，这种结合显然是受RB蛋白磷酸化控制的，但这种结合的实际性质尚不清楚。本研究旨在阐明这一点。为此，我们考虑使用我们创建的 RB 蛋白磷酸化位点特异性抗体。结果，获得了以下研究结果。首先，通过对磷酸化RB蛋白的酶进行详细分析，我们发现Cdk4-cyclin D1磷酸化的共同基序与Cdk2-E/A磷酸化的共同基序不同，我们揭示了其中至少有Ser780。 12-13 磷酸化位点在细胞周期期间被 Cdk4-cyclin D1 特异性磷酸化。相反，我们发现 Thr356 可能是一个不被 Cdk4-cyclin D1 磷酸化但被 Cdk2-E/A 磷酸化的位点。此外，我们使用合成肽作为抗原，生成了对应于所有 13 个假定磷酸化位点（包括磷酸化 Ser780）的抗体。当在同步 T98G 细胞中进行测试时，这些抗体在细胞周期的不同时间检测到磷酸化的 RB 蛋白。此外，使用这些磷酸化位点特异性抗体，我们目前正在分析 RB 蛋白上的哪个位点导致 RB 蛋白在磷酸化时从核结构解离。