G1/S移行期に働くRB蛋白質リン酸化酵素の解析

G1/S 过渡期作用的 RB 蛋白激酶分析

基本信息

批准号：
08265264
负责人：
田矢洋一
金额：
$ 2.56万
依托单位：
National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08265264/
关键词：
RB蛋白質サイクリンD1 サイクリンE サイクリンA Cdk4 Cdk2 リン酸化ペプチド

项目摘要

次のような成果を得た。1.サイクリンD1-Cdk4が、他のサイクリンEやA依存性キナーゼとは異なったアミノ酸配列の所をリン酸化することを明らかにした。サイクリンD1は癌遺伝子にもなるサイクリンであるので、この発見によって、サイクリンD1が細胞癌化に関与するメカニズムの解明が大きく進展すると期待できる。2.RB蛋白質上のSer780はサイクリンD1-Cdk4によってはリン酸化されるけれども、他のサイクリンE/A-Cdk2ではリン酸化されないサイトであることを明らかにした。このサイトはポケットBを過ぎてC末端領域に入った直後に存在する。3.RB蛋白質上に存在する推定13箇所のリン酸化サイトを認識する抗体をすべて作製した。このように、サイクリンEやA依存性キナーゼとサイクリンD1-Cdk4が同じ配列の所をリン酸化するという従来の説は誤りであることが本研究で明らかとなった。RB蛋白質は、サイクリンD1-Cdk4によるリン酸化で、何か特別な活性変化を来すのであろう。そのリン酸化部位をリン酸化されないアミノ酸に変えた変異体も作製できたので、サイクリンD1-Cdk4特異的リン酸化部位の生理的意義が解明されるのではないかと期待される。また、RB蛋白質上の13カ所のリン酸化サイトを区別する抗体は、それぞれのリン酸化サイトがどのキナーゼでリン酸化されるのかということを解析するための強力な道具となるであろう。特に、ラジオアイソトープを使わずに、フォスフォペプチドマッピングも必要なく、簡単な実験でより明瞭な結果が得られることは大きなメリットである。

得到以下结果。 1. 我们发现，细胞周期蛋白 D1-Cdk4 磷酸化的氨基酸序列与其他细胞周期蛋白 E 和 A 依赖性激酶不同。由于cyclin D1是一种同时也作为癌基因的细胞周期蛋白，这一发现有望极大地推进cyclin D1参与细胞癌变机制的阐明。 2.我们发现RB蛋白上的Ser780是一个被cyclin D1-Cdk4磷酸化的位点，但不被其他cyclin E/A-Cdk2磷酸化。该位点就在经过口袋 B 并进入 C 末端区域后出现。 3. 我们创建了识别 RB 蛋白上存在的 13 个假定磷酸化位点的所有抗体。因此，本研究揭示了细胞周期蛋白E和A依赖性激酶以及细胞周期蛋白D1-Cdk4磷酸化相同序列的传统理论是不正确的。 RB 蛋白可能在被细胞周期蛋白 D1-Cdk4 磷酸化后经历一些特殊的活性变化。由于我们能够创建磷酸化位点变为非磷酸化氨基酸的突变体，因此预计细胞周期蛋白D1-Cdk4特异性磷酸化位点的生理意义将得到阐明。此外，区分 RB 蛋白上 13 个磷酸化位点的抗体将成为分析哪些激酶磷酸化每个磷酸化位点的强大工具。特别是，不使用放射性同位素或磷酸肽图谱，通过简单的实验即可获得更清晰的结果，这是一个很大的优点。