RBタンパク質の機能ドメインの解析

RB蛋白功能域分析

基本信息

批准号：
02152130
负责人：
田矢洋一
金额：
$ 2.56万
依托单位：
National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至 1991
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02152130/
关键词：
癌抑制遺伝子 RBタンパク質 cdc2キナ-ゼリン酸化細胞周期

项目摘要

我々はRBタンパク質がM期特異的cdc2キナ-ゼによってin vitroでリン酸化されることを以前に示してきたが,in vivoではRBタンパク質のリン酸化はG_1/S期の境界線から始まりM期まで続く。そして,RBタンパク質による増殖抑制活性がこのリン酸化で解除されると推定される。そこで,G_1/S期特異的なものを含むすべてのRBキナ-ゼを検出することを試みた。その過程で,マウスFM3A細胞のcdc2キナ-ゼがMonoSカラムクロマトグラフィ-でG_1/SとG_2/M特異的な2つのピ-クに分かれ,RBキナ-ゼのピ-クはその2つの間に現れることを見出した。RBタンパク質上にはcdc2キナ-ゼの基質になるための共通配列をもつ部位が11ケ所に存在するが,それらの部位を含む合成ペプチドはすべてこのRBキナ-ゼのピ-ク分画でリン酸化された。さらに,このピ-クとほぼ重なる領域にサイクリンAが検出された。一方,RBタンパク質をリン酸化するキナ-ゼが抗RB抗体によってRBタンパク質と共沈殿されることも見出した。その活性は特にG_1/S期に強いこともわかった。以上の結果はG_1/S期にRBタンパク質をリン酸化する酵素がcdc2キナ-ゼであることを示唆しているけれども,in vivoとin vitroでリン酸化部位が一致するか否か,さらに,そのcdc2キナ-ゼに含まれているサイクリンの種類なども今後明らかにせねばならない。また,我々は,RBタンパク質のC末端から317個のアミノ酸をもつポリペプチドを大腸菌で発現させ,これを用いてRBタンパク質に対するモノクロ-ナル抗体を作製することにも成功した。これらの抗体はRBタンパク質の免疫沈降にも使えることがわかった。

我们之前已经证明，RB 蛋白在体外被 M 期特异性 CDC2 激酶磷酸化，而体内 RB 蛋白的磷酸化从 G_1/S 期边界开始，并持续到 M 期。推测RB蛋白的生长抑制活性通过该磷酸化而释放。因此，我们尝试检测所有 RB 激酶，包括那些特定于 G_1/S 期的激酶。在此过程中，小鼠FM3A细胞中的CDC2激酶通过MonoS柱层析分离成G_1/S和G_2/M特有的两个峰，并且发现RB激酶的峰出现在这两个峰之间。 RB 蛋白上有 11 个位点具有成为 CDC2 激酶底物的共同序列，并且包含这些位点的所有合成肽均在 RB 激酶的峰部分中被磷酸化。此外，在与该峰几乎重叠的区域中检测到细胞周期蛋白A。另一方面，我们还发现磷酸化RB蛋白的激酶通过抗RB抗体与RB蛋白共沉淀。还发现其活性在G_1/S期特别强。虽然上述结果表明G_1/S期磷酸化RB蛋白的酶是CDC2激酶，但尚不清楚体内和体外磷酸化位点是否相同，CDC2激酶所含的细胞周期蛋白类型有待明确。将来。我们还在大肠杆菌中表达了含有RB蛋白C末端317个氨基酸的多肽，并利用该多肽成功制备了针对RB蛋白的单克隆抗体。结果发现这些抗体也可用于RB蛋白的免疫沉淀。