G1/S移行におけるRB蛋白質の役割

RB 蛋白在 G1/S 转变中的作用

基本信息

批准号：
06262230
负责人：
田矢洋一
金额：
$ 1.54万
依托单位：
National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06262230/
关键词：
RB蛋白質細胞周期サイクリンD1 Cdk4 Cdk2 サイクリンE サイクリンA

项目摘要

RB蛋白質の細胞増殖抑制活性は細胞周期特異的なリン酸化で制御されている。しかし、癌化のメカニズムを考える際に特に重要なG1/S移行期においては、サイクリンD、E、Aをそれぞれ含む少なくとも3種類以上のキナーゼがそのリン酸化に関与すると言われながらも、使い分けの機構などが不明であるので、それを解明することを目的とした。そこで、バキュロウィルスベクターを使って、サイクリンD1/Cdk4、サイクリンE/Cdk2とサイクリンA/Cdk2をそれぞれ発現・精製した。これらの精製キナーゼで多くの種類の合成ペプチドのリン酸化を行い、基質特異性の違いを解析した。さらに、RB蛋白質もリン酸化し、リン酸化ペプチドマップを作って、リン酸化部位の違いを解析した。その結果、サイクリンEやA依存性キナーゼによりリン酸化の共通モチーフはS/T-P-X-K/Rであるが、サイクリンD1/Cdk4のそれは明確に異なることがわかった。また、RB蛋白質上にはサイクリンD1/Cdk4特異的なリン酸化部位があることも見い出し、その部位を変異させたRB蛋白質も作製した。さらに、そのリン酸化部位を特異的に認識する抗体も作製できた。したがって、サイクリンEやA依存性キナーゼとサイクリンD1/Cdk4が同じ配列の所をリン酸化するという従来の説は誤りである。我々の実験が成功したのは、それぞれのキナーゼを精製して用いたことにあると思える。RB蛋白質は、サイクリンD1/Cdk4によりリン酸化で、何か特別な活性変化を来すのであろう。サイクリンD1は癌遺伝子にもなるサイクリンであるので、この発見によって、サイクリンD1が細胞癌化に関与するメカニズムの解明が大きく伸展すると期待できる。

RB蛋白的细胞增殖抑制活性由细胞周期性磷酸化控制。但是，在G1/S迁移期间，考虑到癌化机理时，尤其重要，据说至少有三种激酶（包括环素D，E和A）参与了磷酸化，但可以正确使用。由于该机制未知，因此目的是阐明它。因此，使用真空病毒载体，循环D1/CDK4，Cyclin E/CDK2和Cyclin A/CDK2。这些纯化的激酶对许多类型的合成肽进行了磷酸化，以分析底物特异性的差异。此外，RB蛋白被磷酸化，并制定了磷酸化的肽图以分析磷酸化部分的差异。结果，发现磷酸化的常见基序是S/T-P-X-K/R，但是由于循环E和A依赖性激酶，细胞周期蛋白D1/CDK4显然有所不同。此外，RB蛋白上还有一个特殊的磷酸化位点，并创建了改变位点的RB蛋白。此外，已经创建了专门识别磷酸化位点的抗体。因此，传统的理论是，循环E，依赖性激酶和细胞周期蛋白D1/CDK4引起同一序列的磷酸化是不正确的。看来我们的实验是通过完善每个激酶成功使用的。 RB蛋白可能会导致细胞周期蛋白D1/CDK4磷酸化的特殊活性变化。环素D1是一种细胞周期蛋白，也可以是癌症基因，因此可以预见，该发现将大大扩展循环D1涉及转化细胞癌的机制。