HIVプロウィルス活性化過程の分子生物学的研究

HIV原病毒激活过程的分子生物学研究

基本信息

批准号：
05262220
负责人：
岡本尚
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05262220/
关键词：
HIV 転写 NFkB キナーゼシグナル伝達

项目摘要

細胞に潜伏感染しているHIVプロウイルスの活性化に際して、細胞外からのさまざまな刺激が複数のシグナル伝達経路を経て共通の転写因子NFkBへと伝えられ、これがHIVプロウイルスからの転写を促進する。われわれは、NFkBの活性化に関連する新たなセリンキナーゼ(NFkBキナーゼと命名)を同定した。健常人末梢血リンパ球の大量培養を出発材料とし細胞質S100成分を分離し、さらに各種カラムコロマトグラフィーおよびグリセロール密度勾配遠心法によりNFkB/IkB複合体を精製した。精製したNFkB/IkB複合体を存在下でin vitroリン酸化反応を行なったところ、NFkBが活性化され、特異的DNA結合能が誘導された。^<32>P-標識ATPを用いてリン酸化される蛋白分子をSDS-PAGEにて調べた結果、NFkBのサブユニット分子p50とp65にリン酸化の起こっていることが明らかになった。この点は特異抗体を用いた免疫沈降反応とin vitroリン酸化反応でも確認した。さらに、p50およびp65をゲルより切り出して抽出し、セリン残基がリン酸化されていることを確かめた。代表的なセリンキナーゼ阻害剤であるH7とH8ではこの酵素の活性は阻害できなかった。また、本キナーゼは自己リン酸化活性この活性を欠いていたので、基質結合反応により分子量を明らかにした。^<32>P-標識azido-ATPと本酵素を含む複合体を反応させ、UV照射によるクロスリンクを行ない、SDS-PAGEで分析したところ、約43キロダルトンの蛋白分子が同定され、本酵素と考えられた。さらに、他の生化学および血清学的検索より本キナーゼが新規のものであることをつきとめNFkBキナーゼと命名した。NFkBキナーゼはNFkBと複合体を形成して細胞質に存在しているため、NFkBを活性化することで知られる種々のシグナルの標的となっていると考えられる。今後、特異的阻害剤のスクリーニングが進めば、エイズ発病阻止薬として使用できるものが見つかる可能性が高い。また、現在進めている遺伝子クローニングによりこの酵素の遺伝子が同定されれば、エイズプロウイルスの活性化過程の理解が分子レベルでさらに進むことが期待できる。

当潜伏感染细胞的HIV原病毒被激活时，来自细胞外的各种刺激通过多种信号转导途径传递至共同转录因子NFkB，从而促进HIV原病毒的转录。我们发现了一种与 NFkB 激活相关的新丝氨酸激酶（称为 NFkB 激酶）。以大规模培养的健康个体外周血淋巴细胞为起始材料，分离细胞质S100成分，并通过各种柱层析和甘油密度梯度离心方法进一步纯化NFkB/IkB复合物。当在纯化的NFkB/IkB复合物存在下进行体外磷酸化反应时，NFkB被激活并诱导特异性DNA结合能力。 ^ 32 作为通过SDS-PAGE检查使用P标记的ATP磷酸化的蛋白质分子的结果，揭示磷酸化发生在NFkB亚基分子p50和p65中。使用特异性抗体的免疫沉淀反应和体外磷酸化反应也证实了这一点。另外，从凝胶中切下p50和p65并提取，确认丝氨酸残基被磷酸化。典型的丝氨酸激酶抑制剂H7和H8不能抑制该酶的活性。此外，由于该激酶缺乏自磷酸化活性，因此其分子量由底物结合反应确定。 ^<32>当含有P-标记的叠氮基-ATP和该酶的复合物发生反应、通过UV照射交联并通过SDS-PAGE分析时，鉴定出约43千道尔顿的蛋白质分子，并且鉴定出约43千道尔顿的蛋白质分子。据认为是 43 千道尔顿。此外，通过其他生化和血清学搜索，我们发现这种激酶是新颖的，并将其命名为NFkB激酶。由于 NFkB 激酶以与 NFkB 复合物的形式存在于细胞质中，因此它被认为是已知激活 NFkB 的各种信号的靶标。如果将来对特定抑制剂的筛选取得进展，我们很可能会找到一些可以用作预防艾滋病发作的药物。此外，如果通过目前正在进行的基因克隆鉴定出这种酶的基因，预计我们对艾滋病原病毒激活过程的理解将在分子水平上进一步推进。