アフィニティラベリングによるオピオイド受容体の結合部位の決定

通过亲和标记确定阿片受体的结合位点

基本信息

批准号：
06680587
负责人：
下東康幸
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

3‐ニトロ‐2‐ピリジンスルフェニル(Npys)で活性化したチオール基を持つエンケファリンは、オピオイド受容体の遊離チオール基(システイン残基)をシスルフィド結合を介してアフィニティラベルできる。本研究の目的は、機能的に重要な役割を担うこのようなオピオイド受容体システイン残基を同定することである。まず、ラット肝臓より酵素t‐RNA‐チロシンシンターゼを精製し、Npys含有前駆体ペプチドH‐D‐Ala‐Gly‐Phe‐Leu‐Cys(Npys)へのTyrの導入を検討した。しかし、Npys‐エンケファリンの生成は認められたものの、量的な単離まで至らなかった。この理由には酵素標品の純度及び前駆体ペプチドのN端にD‐アミノ酸をもつことなどが考えられた。そこで、微量でもアフィニティラベリングが可能な条件を検討したところ、[^3H]‐[D‐Ala^2,Leu^5]enkephaly‐Cys(Npys)^6はδ型を、[^3H]‐[D‐Ala^2,Leu(CH_2S‐Npys)^5]enkephalinはμ型をそれぞれ100〜150倍も高選択的にラベルできることが判明した。このため、現在^3H‐チロシンを用いて放射ラベルNpys‐エンケファリンの合成を試みている。一方、モルヒネのアンタゴニスト、ナルトレキサミンのアフィニティカラムを作製した。これにラット脳可溶化物を通し、電気泳動で調べたところ、分子量相当の受容体画分が認められ、このカラムの有効性が確認された。現在Npys‐エンケファリンを反応させた脳膜標品のアフィニティ精製を検討している。コンピュータモデリングによるシステイン残基のシミュレーションを実施したところ、受容体の細胞膜外ドメインの第一、第二ループに存在する2個のシステイン残基の可能性が示唆された。このため、立体化学的に堅固なモルヒネの異なる部位にNpys基を導入した誘導体で調べたところ、ラベルされるシステインが2個ある可能性のあることが指摘された。この新規な知見をペプチドのエンケファリンでも確認すべく、Npys誘導体をデザインした。

具有用3-硝基-2-吡啶硫基（Npys）激活的硫醇基团的脑啡肽可以通过硫键亲和标记阿片受体的游离硫醇基团（半胱氨酸残基）。这项研究的目的是鉴定这种在功能上发挥重要作用的阿片受体半胱氨酸残基。首先，我们从大鼠肝脏中纯化了 t-RNA-酪氨酸合酶，并研究了将 Tyr 引入含 Npys 的前体肽 HD-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Cys (Npys) 中。然而，尽管观察到 Npys-脑啡肽的产生，但定量分离是不可能的。其原因被认为是酶制剂的纯度和前体肽 N 末端存在 D-氨基酸。因此，我们研究了即使是微量也可以进行亲和标记的条件，发现[^3H]-[D-Ala^2,Leu^5]enkephaly-Cys(Npys)^6具有δ型，并且[ ^3H]-[ D-Ala^2,Leu(CH_2S-Npys)^5]脑啡肽被发现能够选择性标记μ型100至150倍。因此，我们目前正在尝试使用^3H-酪氨酸合成放射性标记的Npys-脑啡肽。另一方面，我们创建了吗啡拮抗剂纳曲明的亲和柱。当大鼠脑裂解液通过该柱并进行电泳检查时，观察到与分子量相对应的受体级分，证实了该柱的有效性。我们目前正在研究与 Npys-脑啡肽反应的脑膜制剂的亲和纯化。对半胱氨酸残基的计算机建模模拟表明，受体胞外域的第一和第二环中可能存在两个半胱氨酸残基。因此，当我们研究在不同位点引入Npys基团的立体化学刚性吗啡衍生物时，有人指出可能有两个半胱氨酸被标记。为了用肽脑啡肽证实这一新发现，我们设计了 Npys 衍生物。