内分泌撹乱物質のホルモン受容体結合能および活性化能の同時評価測定法の開発

开发同时评价激素受体结合和内分泌干扰物激活能力的测量方法

基本信息

批准号：
13027268
负责人：
下東康幸
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

内分泌撹乱作用が懸念される非常に多数の既存化学物賓を、迅速にスクリーニングする方法が必要とされている。我々は最近、エストロゲン様作用が疑われる化合物500種類について受容体結合試験を実施し、結合親和性がノニルフェノールよりも数十倍から数百倍も強い化合物数種を見い出した。しかしながら、これら化学物質の内分泌撹乱作用の評価においては、受容体結合後の活性発現がホルモン作用なのか、抗ホルモン作用なのか、の判別が必要である。こうしたなか現在検討されているスクリーニング法は、これらについてそれぞれ別途に試験されねばならず、きわめて非効率的である。ところで、ホルモンや化学物質が受容体(アポ型)に結合すると、受容体の構造・コンホメーションが変化する(ホロ型)。女性ホルモン・エストロゲン受容体のリガンド複合体のX線結晶解析から、そのコンホメーション変化の内容はアゴニストと、アンタゴニストでは異なる。本研究ではまず、こうした受容体コンホメーション変化の違いを感知・センシングする抗体の調製を試みた。ホルモン結合による核内受容体(転写因子)のコンホメーションの特徴的な変化は、C末端部αヘリックス(H12)である。そこで、これをエピトープとする抗ウサギ・ポリクローナル抗体を調整した。精製した抗体はアゴニスト・17β-エストラジオール(E2)とアンタゴニスト・4-ヒドロキシタモキシフェンを識別した。さらに、アゴニストでも、E2とエストロン(E1)とを識別した。そこで、一連のアルキルフェノールについて検討したところ、E1様の応答を示すことが判明した。これらを総合的に解析したところ、本抗体のみを用いて検討することで、内分泌撹乱物質のホルモン受容体結合能と活性化能を同時に特異的に定量・測定できるアッセイ系の構築が可能であることが判明した。

需要一种方法来快速筛选大量具有潜在内分泌干扰作用的现有化学品。我们最近对500种疑似具有雌激素作用的化合物进行了受体结合测试，发现几种化合物的结合亲和力比壬基酚强数十至数百倍。然而，在评估这些化学物质的内分泌干扰作用时，需要确定与受体结合后所表达的活性是激素作用还是抗激素作用。在这种情况下，目前正在考虑的筛查方法需要对每一项进行单独测试，效率极低。顺便说一句，当激素或化学物质与受体（apo 型）结合时，受体的结构和构象会发生变化（全息型）。雌性激素/雌激素受体配体复合物的 X 射线晶体分析表明，激动剂和拮抗剂之间的构象变化不同。在这项研究中，我们首先尝试制备能够检测和感知受体构象变化的这些差异的抗体。激素结合后核受体（转录因子）构象的一个特征性变化是 C 端 α 螺旋 (H12)。因此，制备了具有该表位的抗兔多克隆抗体。纯化的抗体可区分激动剂 17β-雌二醇 (E2) 和拮抗剂 4-羟基他莫昔芬。此外，在激动剂中，E2和雌酮(E1)是有区别的。因此，我们研究了一系列烷基酚，发现它们表现出类似 E1 的响应。对这些结果的综合分析表明，仅使用该抗体，就可以构建能够同时且特异性地定量和测量内分泌干扰物的激素受体结合和激活能力的检测系统。