オピオイド受容体単離のための新規アフィニティクロマトグラフィー

用于阿片受体分离的新型亲和色谱

基本信息

批准号：
05680526
负责人：
下東康幸
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

deltaとmuのオピオイド受容体サブタイプを高選択的に識別して、アフィニティラベル(親和標識)するエンケファリンおよびモルヒネの誘導体を分子設計した。これら誘導体の特徴は、3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニル(Npys)基で活性化したチオール基を持つことである。本研究に於いては、これらNpys-誘導体の結合特性に着目し、これらを架橋したアフィニティゲル担体の調製およびオピオイド受容体の精製・単離を試みた。(1)Npys-エンケファリンのアフィニティゲル調製とオピオイド受容体の精製、分取、解析:Npys-システインを6位に組み込んだエンケファリンを化学合成し、AF-アミノトヨパール650ゲルに結合させた。このゲルと可溶化したラット脳のホモジネートを反応させた。次いで、ジスルフィド結合でゲル・エンケファリンに共有結合した受容体を溶出させるために、10mMジチオスレイトール水溶液で処理した。SDS-PAGE電気泳動で調べた結果、delta型受容体に相当するタンパク質が濃縮して検出され、本法が受容体の精製に有効なことが確認された。一方、同時にmu型およびkappa型に相当するタンパク質も検出されたが、これら以外のタンパク質は検出されなかった。従って、ゲル・エンケファリンの選択性を向上させれば、どの受容体の識別精製も可能なことが判明した。現在、ブロッティング分取し、アミノ酸配列を解析中である。(2)アンタゴニストのアフィニティゲル調製:モルヒネのアンタゴニストであるナルトレキサミンの誘導体を化学合成し、上記のゲルに架橋させ、同様にラット脳からの受容体の精製を試みた。その結果、mu型受容体を選択的に精製できた。現在、アミノ酸配列の解析中である。このように、オピオイド受容体の精製・単離の手法としてNpys-エンケファリンあるいはモルヒネのアンタゴニストのアフィニティゲル法の有効性が確認された。

进行分子设计以高度选择性地识别Delta和Mu的阿片受体亚型与亲和力标记（亲和力标记）。这些衍生物的一个特征是它们的硫醇基以3-硝基-2-吡啶磺苯基（NPYS）组激活。在这项研究中，我们专注于这些NPYS衍生物的结合特性，并试图制备已交联的亲和力凝胶载体，以及阿片受体的纯化和分离。（1）制备NPYS-源自NPYS-源自纯化，纯化，制备和分析阿片受体的：在位置6处掺入NPYS-晶体半胱氨酸的Enkephalin化学合成并与AF-aminotoyopearl 650凝胶结合。该凝胶与溶解的大鼠脑匀浆反应。然后，用10 mM水二硫代醇水溶液处理，用二硫键共价结合到凝胶enkephalin。通过SDS-PAGE电泳进行了研究，将与Delta型受体相对应的蛋白浓缩并检测到，证实该方法可有效受体纯化。同时，还同时检测到与MU和KAPPA类型相对应的蛋白质，但未检测到其他蛋白质。因此，已经发现，可以通过提高凝胶Enkephalin的选择性来实现任何受体的差异纯化。目前，正在通过印迹分析氨基酸序列。（2）拮抗剂亲和力凝胶的制备：纳美曲胺的衍生物是吗啡的拮抗剂，是化学合成的，与上述凝胶进行了交联，并类似地尝试从大鼠脑中纯化受体。结果，可以选择性地纯化MU型受体。目前，正在分析氨基酸序列。因此，亲和力凝胶方法对NPYS-源自拮抗剂或吗啡拮抗剂的有效性被证实是纯化和分离阿片受体的方法。