概日リズムのペースメーカーホルモンPDH受容体の発現クローニング

昼夜节律起搏激素PDH受体的表达克隆

基本信息

批准号：
11878113
负责人：
下東康幸
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

カニの色素拡散ホルモンとして発見された神経ペプチドPigment Dispersing Hormone(色素拡散ホルモン・PDH)は、概日リズムの発現ペースメーカーとして考えられている。本研究の目的は、PDHの受容体を同定し、概日リズム発現の分子機構を明らかとすることである。このため、特有の内在性PDHペプチドを持ち、概日リズムの発現が明らかなショウジョウバエについてPDHペプチドの放射ラベル体を化学合成し、脳のホモジネートに対して結合試験を実施し、受容体存在の有無を検討する。ショウジョウバエ・PDHのアミノ酸配列(AsnSerGluLeuIleAsnSerLeuLeuSer LeuProLysAsnMetAsaAspAla-NH_2)はカニのPDHペプチドと3残基が異なるのみである。本研究ではまず、ショウジョウバエのPDHを化学合成した。この化学合成においては、N末端アスパラギンの導入が非常に困難であった。しかも、β転位し易いジペプチド配列AsnSerが2カ所もあり、これに起因する副反応などのため合成に細心の注意が必要であることが判明した。天然相当のペプチドはHPLCにより精製し、これのN末端に^<125>Iでラベルしたボートハンター基(BH)を導入を試みた。PDHペプチドへのBH基の導入は必ずしも効率的ではなかったが、調製した^<125>1-BH-PDHを用いて、ショウジョウバエ脳ホモジネートに対する結合試験を実施した。その結果、^<125>I-BH-PDHの高濃度領域において特異的結合が観察された。しかしながら、その結合は十分なものではなく、さらに、^<25>I-BH-PDHが半減期、結合親和性の観点から最適なトレーサーではないと判断されたため、4位ロイシンをデヒドロロイシンにし、これを還元的にトリチウムラベルすべく、現在PDH前駆体アナログを合成している。本研究の結果は、ショウジョウバエ脳に、しかもの膜画分にPDHの受容体が存在することを強く示唆した。今後、より適正なトレーサーで受容体の同定できることが強く期待される。

神经肽色素分散激素（PDH）是在螃蟹中发现的一种色素分散激素，被认为是表达昼夜节律的起搏器。本研究的目的是鉴定PDH受体并阐明昼夜节律表达的分子机制。为此，我们为果蝇化学合成了放射性标记的PDH肽，该肽具有独特的内源性PDH肽并清晰地表现出昼夜节律，并对大脑匀浆进行结合测试以确定受体是否存在。果蝇PDH (AsnSerGluLeuIleAsnSerLeuLeuSer LeuProLysAsnMetAsaAspAla-NH_2) 的氨基酸序列与蟹PDH 肽仅在三个残基上不同。在这项研究中，我们首先化学合成了果蝇PDH。在该化学合成中，引入N端天冬酰胺极其困难。另外，二肽序列AsnSer有两个位置容易发生β-重排，并且发现由于这些位置会引起副反应，因此在合成时必须非常小心。通过HPLC纯化天然等效肽，并尝试引入在N末端用^ 125 I标记的boathunter基团(BH)。尽管将BH基团引入PDH肽中不一定有效，但我们使用制备的^<125>1-BH-PDH进行了与果蝇脑匀浆的结合测试。结果，在 125 I-BH-PDH的高浓度区域中观察到特异性结合。然而，结合不充分，并且确定25 I-BH-PDH在半衰期和结合亲和力方面不是最佳的示踪剂，因此将4位的亮氨酸替换为脱氢亮氨酸。用氚还原标记它，我们目前正在合成PDH前体类似物。这项研究的结果强烈表明，PDH 受体存在于果蝇大脑中，也存在于膜部分中。未来，强烈期望使用更合适的示踪剂来识别受体。