環境化学物質のアンドロゲン・男性ホルモン受容体結合能の高効率評価測定法の開発

开发环境化学物质与雄激素/雄性激素受体结合能力的高效评价方法

基本信息

批准号：
14042248
负责人：
下東康幸
金额：
$ 2.69万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

内分泌撹乱作用が懸念される非常に多数の既存化学物質を、迅速にスクリーニングする必要がある。化学物質の内分泌撹乱作用の評価においては、受容体結合親和性のみならず、ホルモン作用を持つのか、抗ホルモン作用を持つのかについても試験しなければならない。ところで、ホルモンや化学物質が受容体(アポ型)に結合すると、受容体のコンホメーションが変化する(ホロ型)。我々は最近、エストロゲン受容体についてこうしたコンホメーション変化を感知(センシング)する抗体の調製に成功した。そして、この抗体を用いて化学物質の受容体結合性とホルモン活性を同時に解析・評価できるアッセイ系の構築に成就した。本研究ではまず、特異的な結合性がみられた約300種を含む合計503化学物質について、ポリクローナル抗体を用いた競合ELISA試験の原理に基づくアッセイを実施した。各化学物質の試験溶液(10^<-10>〜10^<-4>M)を一定量の受容体と作用させたのち、固定化した抗原ペプチドと共存下でセンシング抗体に競合させた。解析の結果得られたシグモイド曲線から、最大抗体応答性(%)と抗体応答有効濃度(EC_<50>)を求めた。その結果、図1に示すように、抗体応答有効濃度(横軸)を指標にとして見たとき、活性の強弱について5つのグループに大まかに分けられることが判明した。こうして、現在入手可能なすべての化学物質の試験の結果、第1〜第3グループに天然エストロゲンを含む61化学物質が内分泌撹乱候補物質として認められた。アンドロゲン受容体のコンホメーション変化センシング抗体の作製については、抗体の作製は完了しているものの、現在までリガンド存在、非存在下での有効な応答差を得るに至っていない。一方、アンドロゲンに蛍光核を結合させた新規な蛍光トレーサーを化学合成し、これを用いた結合試験法の開発に成功した。B/F分離なしのアッセイ系確立のため条件検討を継続しているが、現在まで有効な方法の確立に至っていない。

有必要筛选大量有关内分泌干扰作用的现有化学物质。在评估化学物质的内分泌紊乱时，它不仅必须针对受体的亲和力进行测试，而且还必须对其具有激素或抗激素作用。顺便说一句，当激素和化学物质粘合到受体（任命类型）时，受体的结论会发生变化（HOLO类型）。最近，我们成功地制定了感应（传感）雌激素受体的概念变化的抗体。使用这种抗体，可以建立一个可以同时分析和评估化学物质和荷尔蒙活性的受体融合性的测定系统。在这项研究中，基于使用多克隆抗体的ELISA测试原理，总共实施了503种化学物质，包括约300种特殊结合。在每种化学物质（10^<-10> 〜10^<-4> m）的测试溶液充当一定量的受体之后，固定的抗原肽与共存中的传感抗体竞争。根据分析获得的Sigmoid曲线计算了最大抗体反应（％）和抗体反应（EC_ <50>）。结果，当抗体响应有效浓度（水平轴）被视为指数，如图1所示。因此，由于当前所有可用的化学物质，包括天然雌激素在内的61种化学物质在第一至第三组中被认为是内分泌干扰的候选者。关于雄激素受体的转化传感传感抗体的创建，尽管已经完成了抗体的制备，但存在一种现有的和不存在的配体。同时，将荧光核与雄激素结合在一起的一种新的荧光示踪剂已成功合成，并成功地使用了IT开发了一种组合测试方法。已经继续建立一个没有b/f分离的测定系统，但尚未确定为有效。