NK細胞による腫瘍細胞認識の分子機構

NK细胞识别肿瘤细胞的分子机制

基本信息

批准号：
12213024
负责人：
瀧伸介
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

リンパ球、特にNK細胞の活性化分子を明らかにする目的で、NFAT-GFPレポーター遺伝子とレトロウィルスcDNAライブラリーを用いた新たな遺伝子クローニング法を確立した。レトロウィルスベクターを用いたcDNAライブラリーは、様々な細胞に遺伝子導入することができ、さらに遺伝子の発現が持続的であるため機能的スクリーニングを可能にする。一方、スクリーニング用の細胞としてレポーター遺伝子NFAT-GFPを導入し、TCR等の刺激に対してGFPを発現するT細胞ハイブリドーマを作成した。この細胞に、cDNAがCD8とのキメラ分子として発現するように設計したレトロウィルスライブラリーを導入し、抗CD8抗体で活性化された時に、GFP陽性となる細胞をソーティングにて採取し、クローニングした。その結果、脾臓のライブラリーからはIgα,Igβ,CD3ε,ZAP70,Syk等の分子、NK細胞のライブラリーからはFcRγ,DAP12,ZAP70等既にシグナル伝達分子として知られているものが同定され、本手法(NACSと呼ぶ)はリンパ球の活性化分子の探索に有用であることが分かった。加えて、新規分子として細胞表面分子NFAT activating Molecule 1(NFAM1)が見いだされた。NFAM1は細胞内部位にITAM用の配列YxxLx(7-8)YxxMを持ち、リンパ細胞にNFAM1を遺伝子導入すると、NFAT-GFPレポーターを活性化することができた。さらに、このITAM様部位のチロシン(Y)をフェニルアラニンに置換すると、活性化シグナルを伝えないことから、このITAM様部位はNFAM1のシグナル伝達に必須の領域である。NK細胞のcDNAライブラリーからもいくつが未知の分子がクローニングされた。今後は、これら新規分子についても解析を進め、NK細胞の活性化機構を明らかにするとともに、NFAM1の機能について解析を進める予定である。

为了阐明淋巴细胞，特别是NK细胞的激活分子，我们利用NFAT-GFP报告基因和逆转录病毒cDNA文库建立了一种新的基因克隆方法。使用逆转录病毒载体的cDNA文库可用于将基因导入各种细胞中，此外，由于基因表达持续，因此可以进行功能筛选。另一方面，我们将报告基因NFAT-GFP引入细胞中进行筛选，并创建了响应TCR等刺激而表达GFP的T细胞杂交瘤。将设计为表达cDNA作为与CD8的嵌合分子的逆转录病毒文库引入这些细胞中，并通过分选和克隆收集当用抗CD8抗体激活时变为GFP阳性的细胞。结果，从脾脏库中鉴定出Igα、Igβ、CD3ε、ZAP70和Syk等已知的信号转导分子，并从NK细胞库中鉴定出FcRγ、DAP12和ZAP70（称为NACS）。发现对于寻找淋巴细胞激活分子很有用。此外，还发现了一种新的细胞表面分子，即NFAT激活分子1（NFAM1）。 NFAM1在其细胞内位点具有ITAM序列YxxLx(7-8)YxxM，当NFAM1被引入淋巴细胞时，它能够激活NFAT-GFP报告基因。此外，当该ITAM样位点中的酪氨酸（Y）被苯丙氨酸取代时，没有激活信号被传递，表明该ITAM样位点是NFAM1信号转导的重要区域。还从 NK 细胞 cDNA 文库中克隆了数量未知的分子。未来，我们计划进一步分析这些新分子，以阐明NK细胞的激活机制，以及分析NFAM1的功能。