NK細胞による腫瘍細胞認識の分子機構

NK细胞识别肿瘤细胞的分子机制

基本信息

批准号：
12213024
负责人：
瀧伸介
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

リンパ球、特にNK細胞の活性化分子を明らかにする目的で、NFAT-GFPレポーター遺伝子とレトロウィルスcDNAライブラリーを用いた新たな遺伝子クローニング法を確立した。レトロウィルスベクターを用いたcDNAライブラリーは、様々な細胞に遺伝子導入することができ、さらに遺伝子の発現が持続的であるため機能的スクリーニングを可能にする。一方、スクリーニング用の細胞としてレポーター遺伝子NFAT-GFPを導入し、TCR等の刺激に対してGFPを発現するT細胞ハイブリドーマを作成した。この細胞に、cDNAがCD8とのキメラ分子として発現するように設計したレトロウィルスライブラリーを導入し、抗CD8抗体で活性化された時に、GFP陽性となる細胞をソーティングにて採取し、クローニングした。その結果、脾臓のライブラリーからはIgα,Igβ,CD3ε,ZAP70,Syk等の分子、NK細胞のライブラリーからはFcRγ,DAP12,ZAP70等既にシグナル伝達分子として知られているものが同定され、本手法(NACSと呼ぶ)はリンパ球の活性化分子の探索に有用であることが分かった。加えて、新規分子として細胞表面分子NFAT activating Molecule 1(NFAM1)が見いだされた。NFAM1は細胞内部位にITAM用の配列YxxLx(7-8)YxxMを持ち、リンパ細胞にNFAM1を遺伝子導入すると、NFAT-GFPレポーターを活性化することができた。さらに、このITAM様部位のチロシン(Y)をフェニルアラニンに置換すると、活性化シグナルを伝えないことから、このITAM様部位はNFAM1のシグナル伝達に必須の領域である。NK細胞のcDNAライブラリーからもいくつが未知の分子がクローニングされた。今後は、これら新規分子についても解析を進め、NK細胞の活性化機構を明らかにするとともに、NFAM1の機能について解析を進める予定である。

使用NFAT-GFP报告基因和逆转录病毒cDNA文库建立了一种新的基因克隆方法，以阐明淋巴细胞的激活分子，尤其是NK细胞。使用逆转录病毒载体的cDNA文库可以转染到多种细胞中，此外，该基因的持续表达允许进行功能性筛选。另一方面，引入了报告基因NFAT-GFP作为筛选细胞，并产生了表达GFP抗刺激（例如TCR）的T细胞杂交瘤。这些细胞被引入逆转录病毒文库中，旨在表达具有CD8的嵌合分子，并在用抗CD8抗体激活时将GFP阳性变为阳性。结果，从脾脏库中鉴定出Igα，Igβ，CD3ε，ZAP70，SYK等分子，以及FCRγ，DAP12，ZAP70等，这些分子已经称为信号分子，例如FCRγ，DAP12，ZAP70等，并且可以搜索该方法（nacs）。此外，发现了一种新型分子，即细胞表面NFAT激活分子1（NFAM1）。 NFAM1在细胞内部位具有ITAM序列YXXLX（7-8）YXXM，并在将NFAM1转染到淋巴细胞中时，它能够激活NFAT-GFP报告基因。此外，当这种类似ITAM的位点中的酪氨酸（Y）被苯丙氨酸取代时，它不会传递激活信号，因此，这种类似ITAM的位点是NFAM1信号传导的重要区域。还从NK细胞的cDNA文库中克隆了几个未知分子。将来，我们计划继续分析这些新分子，阐明NK细胞的激活机理，并分析NFAM1的功能。