ツ-ハイブリッド系によるArnt及びPASタンパク質に結合する因子の単離

使用双杂交系统分离与 Arnt 和 PAS 蛋白结合的因子

基本信息

批准号：
08680672
负责人：
十川和博
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680672/
关键词：
タンパク-タンパク相互作用転写因子コアクティベータ-

项目摘要

ArntのC端末部に存在する転写活性化ドメインを除いた部分を、GAL4のDNA結合部位のC末端につなぎ、いわゆる、酵母のツ-ハイブリッドシステムを用いて、Arnt結合タンパク質をヒト胎児肝臓のcDNAライブラリーと、マウスリンフォーマのcDNAライグラリー、それぞれ約百万個ずつスクリーニングした。その結果ヒト胎児肝臓ライブラリーから4種の、マウスリンフォーマライブラリーから11種のクローンを得た。この中で既知のクローンは5種であった。HLHとPASドメインをもつクローンはなかった。Arntとの相互作用が比較的強い、有望と思われるものを選びさらに検討した。N末端部分がかけていたので、マウス脾臓cDNAライブラリーをスクリーニングし、full lengthのcDNAを得た。このcDNAクローンは534残基のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸に富み、全体としてはプラスにチャージしていた。酵母で発現させその活性を調べたところ、AhリセプターとArntとの複合体の転写活性を、数倍強めることが分かった。またHIF-1aとArntとの複合体の転写活性も増強した。これらの結果は、見いだされたタンパク質が、Arnt依存性の転写を活性化するコアティベータ-であることを強く示唆する。ほ乳類培養細胞では、内在性の発現があるせいか現在までのところ、酵母で見られた活性は観察されていない。ノーザンブロッティングの結果、本遺伝子は全ての組織で発現していた。また細胞内局在を調べた結果、核に存在していることが分かった。

在ARNT C末端中排除转录活化域的部分与GAL4 DNA连接位点的C末端相连，所谓的酵母TSU杂种系统，ARNT键蛋白是人类胎儿肝脏的cDNA图书馆和嘴林前cDNA集会，每个集会大约是一百万。结果，从人类胎儿肝文库中获得了四种摩服蛋白植物库，获得了11个克隆。其中，有五个已知的克隆。没有HLH和PAS域的克隆。我们选择了似乎很有希望的东西，并且与ARNT相对较强。当应用n端部分时，我筛选了小鼠脾脏cDNA库并获得了全长cDNA。该cDNA克隆编码了由534个残基的氨基酸组成的蛋白质。它富含碱性氨基酸和酸性氨基酸，并且从整体上进行了积极的积极。检查酵母中的活性并检查活性，发现AH恢复器与ARNT之间的复合物的转录活性增加了几次。 HIF-1A和ARNT之间复合物的转录活性也增加了。这些结果强烈表明，发现的蛋白质是激活ARNT依赖性转录的外套β。在哺乳动物培养细胞中，到目前为止尚未观察到酵母中看到的活性，这可能是由于内部性质的表达。由于北印迹，该基因在所有组织中均表达。研究细胞内位置表明它存在于核中。