精製した転写因子を用いたP4501A1遺伝子の誘導的発現のインビトロ解析

使用纯化的转录因子体外分析 P4501A1 基因的诱导表达

基本信息

批准号：
06680601
负责人：
十川和博
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680601/
关键词：
Ahリセプター Arnt Sp1 バキュロウイルス発現系 RNAポリメラーゼ

项目摘要

P4501A1遺伝子の転写に必要な三つの転写因子Ahリセプター、Arnt、Splをバキュロウイルスの発現系を使って調製した。得られた粗抽出物をさらにニッケルアルフィニティークロマトグラフィーでさらに精製した。この操作で5x10^8の細胞から20μgのAhリセプター、80μgのArnt、80μgのSp1をそれぞれ純度20%,80%,80%で得ることができた。またSp1についてはHeLa細胞核抽出液からも分離精製した。これらの因子とその特異性抗体を使ってSp1とAhリセプター、Sp1とArntが結合することを見いだした。さらに、これらの精製因子と、AhリセプターとArntのヘテロダイマーが認識するXREを4個、Sp1が認識するGCボックスを1個プロモーターにもつGフリーカセットをテンプレートに使ってインビトロ転写実験を行った。基本転写因子群はRNAポリメラーゼを含むHeLa細胞の核抽出液で、すでにわかっているSp1の転写効果をまず検討したところ、バキュロウイルス発現系で調製したSp1よりもHeLa細胞由来のSp1の方が転写活性が強かった。バキュロウイルス発現系のSp1はコンフォメーションが十分でない可能性がある。つぎにAhリセプター、Arntの添加効果を調べたところSp1のみに比較して約2倍の転写活性化を観察した。Ahリセプター、Arntだけでは転写活性化はおきなかった。これらの結果は動物実験や培養細胞でのP4501A1遺伝子のAhリセプターとArntを介した転写活性化(約30倍)には及ばないものの3個の転写因子の寄与を確認したことになり、一定の成果を得ることができた。

P4501A1使用真空表达系统制备了P4501a1基因转录所需的三个转移因子Ah reseptor，ARNT和SPL。用镍字母色谱进一步完善所获得的粗提取物。通过此操作，从5x10^8细胞中获得了20μgAhreaseptor，80μgARNT和80μgSP1。 SP1也分离并从HeLa细胞核提取物中进行了完善。我们发现，使用这些因素及其特定抗体将SP1和AH恢复器，SP1和ARNT组合在一起。此外，我们使用这些纯化因子和四个由AH受体和ARNT的异二聚体识别的XRE进行了Invitro转移实验，而SP1在一个专业电机上识别的GC盒。基本转移因子组是包括RNA聚合酶在内的HeLa细胞的核提取物，首先考虑SP1的转移效应时，与液泡病毒表达系统中制备的SP1相比，HELA细胞衍生的SP1被转移很强。液泡病毒表达SP1可能没有足够的困惑。接下来，当检查AH受体和ARNT的添加效应时，观察到转录激活的两倍是SP1的两倍。 AH恢复器和ARNT没有转录激活。这些结果已被证实，尽管在动物实验和培养细胞中，它们不如通过AH恢复体和P4501A1基因的ARNT进行转录激活（约30次），但已确认了三个转录因子。