精製した転写因子を用いたP4501A1遺伝子の誘導的発現のインビトロ解析

使用纯化的转录因子体外分析 P4501A1 基因的诱导表达

• 批准号: 06680601
• 负责人: 十川 和博
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680601/
• 关键词: Ahリセプター; Arnt; Sp1; バキュロウイルス発現系; RNAポリメラーゼ; Ahリセプター; Arnt; Sp1; バキュロウイルス発現系; RNAポリメラーゼ

P4501A1遺伝子の転写に必要な三つの転写因子Ahリセプター、Arnt、Splをバキュロウイルスの発現系を使って調製した。得られた粗抽出物をさらにニッケルアルフィニティークロマトグラフィーでさらに精製した。この操作で5x10^8の細胞から20μgのAhリセプター、80μgのArnt、80μgのSp1をそれぞれ純度20%,80%,80%で得ることができた。またSp1についてはHeLa細胞核抽出液からも分離精製した。これらの因子とその特異性抗体を使ってSp1とAhリセプター、Sp1とArntが結合することを見いだした。さらに、これらの精製因子と、AhリセプターとArntのヘテロダイマーが認識するXREを4個、Sp1が認識するGCボックスを1個プロモーターにもつGフリーカセットをテンプレートに使ってインビトロ転写実験を行った。基本転写因子群はRNAポリメラーゼを含むHeLa細胞の核抽出液で、すでにわかっているSp1の転写効果をまず検討したところ、バキュロウイルス発現系で調製したSp1よりもHeLa細胞由来のSp1の方が転写活性が強かった。バキュロウイルス発現系のSp1はコンフォメーションが十分でない可能性がある。つぎにAhリセプター、Arntの添加効果を調べたところSp1のみに比較して約2倍の転写活性化を観察した。Ahリセプター、Arntだけでは転写活性化はおきなかった。これらの結果は動物実験や培養細胞でのP4501A1遺伝子のAhリセプターとArntを介した転写活性化(約30倍)には及ばないものの3個の転写因子の寄与を確認したことになり、一定の成果を得ることができた。

使用杆状病毒表达系统制备了三个转录因子，即ARNT和SPL，即P4501a1基因的转录所需的三个转录因子。通过镍藻色谱法进一步纯化了所得的粗提取物。通过此过程，从5x10^8细胞获得20％的AH受体，80μgARNT和80μgSP1，纯度分别为20％，80％和80％。 SP1也被分离并从HeLa细胞的核提取物中纯化。这些因素及其特异性抗体用于在SP1和AH受体之间以及SP1和ARNT之间找到结合。此外，使用这些纯化因子进行了体外转录实验，四个由AH受体和ARNT异二聚体识别的XRE，以及一个由SP1识别为模板的GC盒。基本的转录因子是含有RNA聚合酶的HeLa细胞的核提取物，当我们首次检查SP1的转录作用时，已经知道，从HELA细胞中得出的SP1比使用杆状病毒表达系统制备的SP1具有更强的转录活性。杆状病毒表达系统中的SP1可能不足。接下来，我们研究了添加AH受体和ARNT的效果，并观察到转录激活仅是SP1的两倍。 AH受体并单独使用AR不实现转录激活。这些结果证实了三个转录因子的贡献，尽管在动物实验和培养细胞中不如AH受体和ARNT介导的转录激活（约30次），并且实现了某些结果。