薬物誘導型Pー450遺伝子プロモ-タ-に働く転写因子の解析

药物诱导的P-450基因启动子转录因子分析

基本信息

批准号：
02680149
负责人：
十川和博
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02680149/
关键词：
転写因子薬物誘導 Zinc Finger構造 GCボックス

项目摘要

Pー450c遺伝子の誘導的発現にはプロモ-タ-領域に存在するBTEと名づけたエレメントが必要であり、そこに結合する因子として全蛋白質領域を含むcDNAクロ-ンをラット肝臓cDNAライブラリ-より得、BTEーBと名づけた。BTEーBはアミノ酸244残基から成り、C末端付近に3つのZinc Finger構造があった。またその他の部分は現在まで報告されている蛋白質と構造上の類似性はなかった。本cDNAを大腸菌で発現させるため、T7ファ-ジのプロモ-タ-の下流にBTEーBcDNAを接合したプラスミドを作製し,T7ポリメラ-ゼ活性をもつ大腸菌BL21株をトランスフォ-ムした。IPTG処理をした大腸菌から得られた抽出液にはBTEに結合する活性が確認された。また大腸菌で発現したBTEーBはBTEの他、種々のGCボックス塩基配列をもつオリゴヌクレオチドプロ-ブに結合した。現在この抽出液からBTEーBを精製中である。またBTEーBが転写調節因子として働く可能性を培養細胞を用いたトランスフェクション実験で検討中である。同じく薬物代謝型のPー450であるフェノバルビタ-ルで誘導されるPー450b遺伝子のプロモ-タ-領域にBTE類似の塩基配列を見出したのでその転写活性について検討した。Pー450b遺伝子上流とCAT構造遺伝子を接合したプラスミドを作製し、ラット肝癌由来のH4IIEC3細胞にトランスフェクションしたところ、強いCAT活性が見出されたがBTE類似配列をそのプラスミドから欠失させるとCAT活性はほぼ消失した。またHeLa細胞抽出液を用いたinvitro転写実験でもこのBTE類似配列が転写を促進することを見出した。また大腸菌で発現したBTEーBはこのPー450bBTE類似配列に結合した。

P-450c基因的诱导表达需要存在于启动子区域的称为BTE的元件，并且使用来自大鼠肝脏cDNA文库的包含整个蛋白质区域的cDNA克隆作为与其结合的因子，将其命名为BTE。 -B。 BTE-B 由 244 个氨基酸残基组成，在 C 末端附近具有三个锌指结构。此外，其他部分与迄今为止报道的蛋白质没有结构相似性。为了在大肠杆菌中表达该cDNA，我们创建了一个质粒，其中BTE-B cDNA结合在T7噬菌体启动子的下游，并转化了具有T7聚合酶活性的大肠杆菌BL21菌株。从 IPTG 处理的大肠杆菌中获得的提取物中证实了 BTE 结合活性。另外，在大肠杆菌中表达的BTE-B除了BTE之外还与具有各种GC盒碱基序列的寡核苷酸探针结合。目前正在从该提取物中纯化 BTE-B。我们还通过使用培养细胞的转染实验研究 BTE-B 作为转录调节因子的可能性。我们在 P-450b 基因的启动子区域发现了与 BTE 相似的核苷酸序列，该序列也是由药物代谢 P-450 苯巴比妥诱导的，并研究了其转录活性。当我们创建了一个连接 P-450b 基因上游和 CAT 结构基因的质粒并将其转染到大鼠肝癌来源的 H4IIEC3 细胞中时，发现了很强的 CAT 活性，但是当从质粒中删除 BTE 样序列时，CAT活动几乎消失了。我们还发现，在使用 HeLa 细胞提取物的体外转录实验中，这种类似 BTE 的序列促进了转录。此外，在大肠杆菌中表达的 BTE-B 与该 P-450bBTE 样序列结合。