薬物代謝酵素の外来異物による誘導に関するタンパク質リン酸化機構の解明

阐明与异物诱导药物代谢酶相关的蛋白质磷酸化机制

基本信息

批准号：
07680669
负责人：
十川和博
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07680669/
关键词：
Ahリセプター Arnt タンパク質リン酸化

项目摘要

薬物代謝の代表的な酵素であるチトクロームP-4501A1はベンツピレンやダイオキシンなどの環境汚染物質によって誘導される。この誘導には外来異物をリガンドとして受容するAhリセプター(AhR)とArntと名づけられたタンパク質がヘテロダイマーを形成し、遺伝子転写調節領域に存在するXRE(Xenobibtic Respensive Element)に結合することによっておこる。またこの過程にAhR/Arntのリン酸化が必要であることが示唆されている。我々はこのAhRとArntのcDNAを発現プラスミドに組み込み培養細胞(293cell)で発現させた。このとき培養液に^<32>Pで標識した無機リン酸を加え、AhRとArntの特異抗体で免疫沈降を行い、SDSPAGEによって解析したところ、AhRもArntもリン酸化タンパク質であることが判明した。ただしAhRについては用いた抗体の特異性が低いためとAhRの発現量が少ないため非常に弱いシグナルしか得られなかった。Arntに関してリン酸化アミノ酸を分析したところセリン残量がリン酸化されていることがわかった。これとは別にAhRとArntをバキュロウイルス系で大量発現し、DNA結合活性をXREをプローブとしてゲルシフトアッセイで調べた。その結果ヘテロダイマーによる特異的な結合が観察された。この系で発現したAhRとArntがリン酸化されているかどうかは不明であるが、発現したAhRとArntをバクテリア由来とウシ小腸由来のアルカリホスファターゼで処理したところ、そのDNA結合活性は変化しなかった。このことからAhRとArntのヘテロダイマーのDNA結合活性にはリン酸化の影響がないことが示唆された。以上の結果からAhR/Arntによる誘導系に対するリン酸化の影響はDNA結合以外のところで必要であることが推定された。

细胞色素P-4501A1是药物代谢的典型酶，由苯并芘和二恶英等环境污染物诱导产生。当接受外来物质作为配体的 Ah 受体 (AhR) 和名为 Arnt 的蛋白质形成异二聚体时，就会发生这种诱导，该异二聚体与基因转录调控区中存在的 XRE（异种反应元件）结合。也有人提出该过程需要 AhR/Arnt 磷酸化。我们将 AhR 和 Arnt cDNA 整合到表达质粒中，并在培养细胞（293cell）中表达它们。此时，将用^ 32 P标记的无机磷酸添加到培养基中，并用AhR和Arnt的特异性抗体进行免疫沉淀，通过SDSPAGE分析表明AhR和Arnt都是磷酸化蛋白质。然而，对于AhR，由于所用抗体的特异性低以及AhR的表达水平低，仅获得非常微弱的信号。对 Arnt 中磷酸化氨基酸的分析表明，剩余的丝氨酸被磷酸化。另外，使用杆状病毒系统大量表达AhR和Arnt，并使用XRE作为探针通过凝胶位移测定检查它们的DNA结合活性。结果，观察到异源二聚体的特异性结合。目前尚不清楚该系统中表达的AhR和Arnt是否被磷酸化，但当表达的AhR和Arnt用来自细菌和牛小肠的碱性磷酸酶处理时，它们的DNA结合活性没有改变。这表明磷酸化对 AhR 和 Arnt 异二聚体的 DNA 结合活性没有影响。从以上结果推断，磷酸化对AhR/Arnt诱导的诱导系统的影响在DNA结合以外的领域中是必要的。