細胞チップを用いた抗原特異的T細胞の迅速・高効率な検出・作製法の開発

利用细胞芯片开发抗原特异性T细胞的快速高效检测和生产方法

基本信息

批准号：
11F01415
负责人：
村口篤
金额：
$ 1.15万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、がんの免疫療法が注目を集めているが、治療の有効性を評価するよいシステムがないことが問題となっている。本研究では、金らが確立した画期的なリンパ球マイクロチップ法(Jin A. et al., Nature Medicine ; 15 : 1088-1092, 2009)を応用し、がん特異的T細胞を迅速にかつ高精度で検出し、癌特異的T細胞を迅速に作製することができる基盤技術を開発することを目的としている。これまでに、抗原特異性が既知のTCRトランスジェニックマウスのT細胞を用い、細胞チップ上で抗原ペプチドで刺激することにより、抗原ペプチド刺激特異的なT細胞のサイトカイン産生を検出できることを示してきた。平成25年度は、この結果を踏まえ、ヒトのT細胞を用い、細胞チップ上で抗原特異的T細胞が検出できるかを検討した。抗原として、ほとんどの日本人が不顕性感染しているEBウイルスのペプチドを用いた。まず、ドナーの末梢血リンパ球をEBウイルスペプチドで刺激し、フローサイトメータを用いて解析し、EBウイルスペプチドに反応しサイトカインを産生するリンパ球が存在するかを確認した。次に、EBウイルスペプチドに反応するリンパ球を含むリンパ球を細胞チップに播種し、1個1個の細胞をマイクロウェルに格納した。チップにEBウイルスペプチドを添加し、細胞を刺激したところ、6時間後に、EBウイルスペプチド刺激特異的にサイトカインを産生する細胞を検出することができた。抗原刺激特異的にサイトカインを産生したT細胞を1個ずつ回収し、回収したリンパ球より、TCR c DNAをRT-PCRにて増幅した。TCRの配列を解析した結果、EBウイルスの特異的なTCRが取得されたことを確認した。以上より、細胞チップを用いることで、抗原に特異的なTリンパ球を、短時間に、非常に高感度に検出できることを示すことができた。今後、この技術をがん免疫治療の効果の評価、及び、がん免疫治療に有効なTCRの取得に応用したい。

近年来，癌症免疫疗法引起了人们的关注，但是缺乏评估疗法有效性的良好系统已成为一个问题。这项研究旨在开发一种基本技术，该技术可以快速，准确地检测到癌症特异性的T细胞，并通过应用Kim等人建立的开创性淋巴细胞微芯片方法来快速地产生癌症特异性T细胞。（Jin A.等，《自然医学》； 15：1088-1092，2009）迅速发展癌症特异性T细胞。迄今为止，已经表明，使用具有已知抗原特异性的TCR转基因小鼠的T细胞在细胞芯片上刺激T细胞在细胞芯片上刺激T细胞，可以检测到抗原肽刺激的T细胞的细胞因子产生。基于这些结果，在2013财年，我们研究了使用人T细胞在细胞芯片上是否可以检测到抗原特异性T细胞。作为抗原，使用了大多数日本人患有亚临床感染的EB病毒的肽。首先，用EB病毒肽刺激供体的外周血淋巴细胞，并使用流式细胞仪进行分析，以确认是否有淋巴细胞对EB病毒肽反应并产生细胞因子。接下来，将含有对EB病毒肽反应的淋巴细胞的淋巴细胞播种在细胞芯片上，并将每个细胞储存在微孔中。当将EB病毒肽添加到碎屑并刺激细胞中时，在6小时后检测到专门刺激EB病毒肽的细胞因子的细胞。一一收集产生特异性抗原刺激的细胞因子的T细胞，并通过RT-PCR从回收的淋巴细胞中扩增TCR C DNA。分析了TCR的序列，并确认获得了EB病毒的特定TCR。从上面可以证明，使用细胞芯片可以在短时间内非常敏感地检测抗原特异性T淋巴细胞。将来，我们希望将该技术应用于评估癌症免疫疗法的有效性并获得TCR，这对癌症免疫疗法有效。