細胞チップを用いた抗原特異的T細胞の迅速・高効率な検出・作製法の開発

利用细胞芯片开发抗原特异性T细胞的快速高效检测和生产方法

基本信息

批准号：
11F01415
负责人：
村口篤
金额：
$ 1.15万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、がんの免疫療法が注目を集めているが、治療の有効性を評価するよいシステムがないことが問題となっている。本研究では、金らが確立した画期的なリンパ球マイクロチップ法(Jin A. et al., Nature Medicine ; 15 : 1088-1092, 2009)を応用し、がん特異的T細胞を迅速にかつ高精度で検出し、癌特異的T細胞を迅速に作製することができる基盤技術を開発することを目的としている。これまでに、抗原特異性が既知のTCRトランスジェニックマウスのT細胞を用い、細胞チップ上で抗原ペプチドで刺激することにより、抗原ペプチド刺激特異的なT細胞のサイトカイン産生を検出できることを示してきた。平成25年度は、この結果を踏まえ、ヒトのT細胞を用い、細胞チップ上で抗原特異的T細胞が検出できるかを検討した。抗原として、ほとんどの日本人が不顕性感染しているEBウイルスのペプチドを用いた。まず、ドナーの末梢血リンパ球をEBウイルスペプチドで刺激し、フローサイトメータを用いて解析し、EBウイルスペプチドに反応しサイトカインを産生するリンパ球が存在するかを確認した。次に、EBウイルスペプチドに反応するリンパ球を含むリンパ球を細胞チップに播種し、1個1個の細胞をマイクロウェルに格納した。チップにEBウイルスペプチドを添加し、細胞を刺激したところ、6時間後に、EBウイルスペプチド刺激特異的にサイトカインを産生する細胞を検出することができた。抗原刺激特異的にサイトカインを産生したT細胞を1個ずつ回収し、回収したリンパ球より、TCR c DNAをRT-PCRにて増幅した。TCRの配列を解析した結果、EBウイルスの特異的なTCRが取得されたことを確認した。以上より、細胞チップを用いることで、抗原に特異的なTリンパ球を、短時間に、非常に高感度に検出できることを示すことができた。今後、この技術をがん免疫治療の効果の評価、及び、がん免疫治療に有効なTCRの取得に応用したい。

癌症免疫治疗近年来引起了人们的关注，但缺乏良好的治疗效果评估系统成为了一个问题。在本研究中，我们应用Jin A.等人建立的创新淋巴细胞微芯片方法（Nature Medicine；15：1088-1092，2009）来快速收集癌症特异性T细胞，目的是开发能够检测的基础技术。高精度癌症特异性T细胞，快速生成癌症特异性T细胞。迄今为止，我们已经证明，通过使用来自具有已知抗原特异性的TCR转基因小鼠的T细胞，并用细胞芯片上的抗原肽刺激它们，可以检测对抗原肽刺激具有特异性的T细胞产生的细胞因子。基于这些结果，我们在2013财年研究了是否可以使用人类T细胞在细胞芯片上检测抗原特异性T细胞。作为抗原，我们使用了 EEB 病毒的肽，大多数日本人都是亚临床感染的。首先，用 EB 病毒肽刺激供体外周血淋巴细胞，并使用流式细胞仪进行分析，以确认是否存在对 EB 病毒肽做出反应并产生细胞因子的淋巴细胞。接下来，将淋巴细胞（包括与EB病毒肽反应的淋巴细胞）接种到细胞芯片上，并将每个细胞储存在微孔中。当在芯片中添加EB病毒肽刺激细胞时，6小时后可以检测到产生由EB病毒肽特异性刺激的细胞因子的细胞。产生对抗原刺激具有特异性的细胞因子的T细胞被一一收集，并通过RT-PCR从收集的淋巴细胞中扩增TCR c DNA。分析TCR序列的结果，确认获得了EB病毒特异的TCR。综上所述，我们证明了使用细胞芯片可以在短时间内以极高的灵敏度检测抗原特异性T淋巴细胞。未来，我们希望将该技术应用于癌症免疫治疗效果的评估以及对癌症免疫治疗有效的TCR的获取。