リンパ球マイクロアレイを用いた免疫機能の診断・治療システムの開発

淋巴细胞微阵列免疫功能诊疗系统的开发

基本信息

批准号：
18048019
负责人：
村口篤
金额：
$ 3.52万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18048019/
关键词：
感染症抗体医薬細胞チップ抗体遺伝子リコンビナント抗体

项目摘要

本研究で以下の研究成果を得た。1.抗原特異的Bリンパ球の自動検出法の検討を行った。リンパ球マイクロウエルアレイの検出方法の条件をさらに検討し、利用率、検出感度、再現性の向上を図った。特に、リンパ球チップの利用率が現在5%前後であり、低頻度の抗原特異的Bリンパ球検出系の課題となっているので、利用率が10%以上の新しいチップを開発した。さらにCCDカメラを用いた新しいスキャナーを改良し、1秒間隔で細胞内Ca濃度の測定を可能とした。2.リンパ球チップを用いた病原体特異的Bリンパ球の検出、抗体遺伝子のクローニング、リコンビナント抗体の作成を行った。HBsワクチン接種でHBs抗原陽性の健常人をボランティアとし、リンパ球マイクロウェルアレイを用いてHBs抗原特異的Bリンパ球の同定および抗体遺伝子解析を行った。HBs特異的抗体遺伝子のV領域配列をヒトIgGのC領域配列と結合させた発現型ベクターを構築し動物細胞株(293T)に導入し、リコンビナント抗体を得た。現在抗体に結合する20個以上のヒトリコンビナント抗体を取得している。3.リンパ球チップの応用として抗体産生細胞の検出を試みた。免疫したマウスの脾細胞あるいほHBsワクチン接種によりHBs抗原陽性の健常人ボランティアの末梢血のBリンパ球を、抗原をコートしたリンパ球チップに1個づつ播種し、特異的抗体産生細胞の検出をFLISPOT法で行った。この検出系の確立により、抗原特異的抗体のmRNAを大量に発現すう1個の交代産生細胞を得ることが可能となり、リコンビナントの作成が画期的に容易になった。

本研究获得以下研究结果。 1. 我们研究了一种抗原特异性B淋巴细胞的自动检测方法。我们进一步研究了淋巴细胞微孔阵列检测方法的条件，旨在提高利用率、检测灵敏度和重现性。特别是目前淋巴细胞芯片的利用率在5%左右，这对于低频抗原特异性B淋巴细胞检测系统来说是一个难题，所以我们开发了一种利用率超过10%的新芯片。此外，改进了使用 CCD 相机的新型扫描仪，可以以 1 秒的间隔测量细胞内 Ca 浓度。 2. 我们利用淋巴细胞芯片检测病原体特异性B淋巴细胞，克隆抗体基因，并创建重组抗体。我们以接受 HBs 疫苗接种后 HBsAg 阳性的健康志愿者为对象，使用淋巴细胞微孔阵列来鉴定 HBsAg 特异性 B 淋巴细胞并进行抗体基因分析。构建将HBs特异性抗体基因的V区序列与人IgG的C区序列组合的表达载体，导入动物细胞系(293T)中，得到重组抗体。目前，我们已经获得了20多种与抗体结合的人源重组抗体。 3. 作为淋巴细胞芯片的应用，我们尝试检测抗体产生细胞。将免疫小鼠的脾细胞或因接种 HBs 疫苗而呈 HBs 抗原阳性的健康志愿者的外周血 B 淋巴细胞逐一接种到抗原包被的淋巴细胞芯片上，使用 FLISPOT 方法检测特异性抗体产生细胞。该检测系统的建立使得获得表达大量抗原特异性抗体mRNA的单一替代生产细胞成为可能，从而使重组生产变得更加容易。