ヒト組み換え活性化遺伝子(RAG)のゲノム構造の解析と転写調節機構の解明

人类重组激活基因（RAG）基因组结构分析及转录调控机制阐明

基本信息

批准号：
09271211
负责人：
村口篤
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Toyama Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)ヒトRAGのゲノム構造に関する研究:ヒトRAG-1cDNAの断片を用いてRAG-1遺伝子の第一エクソンと第二エクソンを含むクローンを単離し、RAG1遺伝子のゲノム構造と転写開始点を決定した。次に、RAG2cDNAをプローブにしてRAG2遺伝子の第1エクソンと第2エクソンを含むクローンHRAG-4を単離し、制限酵素地図の作成および一部の塩基配列を決定した。同時に、RAG2遺伝子の転写開始点を決定し、RAG2ゲノム遺伝子構造を決定した。2)ヒトRAGのクロマチン構造に関する研究:RAG-1発現、非発現細胞、あるいは非リンパ系細胞におけるDNaseI高感受性領域の解析を行い、転写開始点の上流約3.5kbp(HS1)、約0.8kbp(HS2)、転写開始点付近(HS3)、イントロン(HS4)に合計4箇所のDNaseI高感受性領域が存在すること、HS1は全ての細胞株に認められたがHS2、3、4はRAG-1発現細胞株に特異的に認められることを明らかにした。3)ヒトRAGの転写調節に関する研究:RAG1遺伝子の転写開始点5′上流-2.8kbpまでの領域について、さまざまな挿入断片をルシフェラーゼ遺伝子に連結したベクターを作成しプロモーター活性を測定した。その結果、転写開始点5′上流-110bpから-86bpの領域がRAG-1遺伝子の基本的プロモーター活性に必要であること、転写開始点の上流97bpにあるCCAATboxがプロモーター活性に必須であることを明らかにした。この領域はDNaseI高感受性部位HS3に含まれていることから、RAG1の発現は、ccaat部位のクロマチン構造変化により制御されていると結論した。現在、同様の手法を用いてRAG2の転写調節に関する研究および他のシスエレメントに関する研究を行っている。

1）人RAG基因组结构研究：利用人RAG-1 cDNA片段分离出含有RAG-1基因第一和第二外显子的克隆，并获得RAG1基因的基因组结构和转录起始位点决定。。接下来，使用RAG2 cDNA作为探针，分离含有RAG2基因的第一和第二外显子的克隆HRAG-4，创建限制酶图谱，并确定部分核苷酸序列。同时确定了RAG2基因的转录起始位点，并确定了RAG2基因组的基因结构。 2）人RAG染色质结构的研究：我们分析了RAG-1表达细胞、非表达细胞或非淋巴细胞中的DNaseI敏感区域，发现转录起始位点上游，大约3.5 kbp (HS1)，约 0.8 kbp (HS2)，在转录起始位点（HS3）和内含子（HS4）附近共有四个 DNaseI 高敏感区域；HS1 在所有细胞系中均发现，但 HS2、3 和 4 在 RAG-1 表达细胞系中发现。据透露，这是专门认可的。 3)人RAG转录调控的研究：构建载体，其中将各种插入片段连接至RAG1基因转录起始点上游5'上游至2.8kbp区域的荧光素酶基因，并测量启动子活性。结果，我们发现转录起始点上游5'-110 bp到-86 bp的区域是RAG-1基因基本启动子活性所必需的，并且CCAATbox位于转录起始点上游97 bp起始点对于揭示启动子活性至关重要。由于该区域包含在 DNaseI 敏感位点 HS3 中，因此我们得出结论，RAG1 表达受 ccaat 位点染色质结构变化的调节。我们目前正在使用类似技术对 RAG2 和其他顺式元件的转录调控进行研究。