次世代マイクロチップを用いた単一リンパ球機能のハイスループット解析法の開発

使用下一代微芯片开发单淋巴细胞功能的高通量分析方法

基本信息

批准号：
20034020
负责人：
村口篤
金额：
$ 4.86万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、我々が世界で初めて開発した「リンパ球チップ」をさらにブラッシュアップし、感染症患者の血液から病原菌特異的なヒトBリンパ球を効率良く同定し、そのBリンパ球が産生する抗体遺伝子を迅速に単離し、ヒト型リコンビンナント抗体を1週間以内に作製することで、新興感染症や細菌を用いた生物テロに対する世界最速の感染症治療戦略に貢献することを目指す。平成21年度の研究実績は以下のとおりである。【1】リンパ球チップの改良:マイクロアレイスキャナーを2蛍光対応型に改良し、2つの異なるカルシウム蛍光色素を用い、正確な陽性細胞の検出する系を確立した。また、CCDカメラを用いた新しいマイクロアレイスキャナーの開発を行った。すなわち、抗原刺激後、10mSec毎、3分間、細胞蛍光強度を撮影し、その蛍光強度のデータをコンピューターで解析することが可能となった。このことで、抗原濃度や抗原のエピトープ数さらに抗原受容体の数や親和性等によって規定される細胞刺激の強弱に対するリンパ球クローンの反応差を確認することが可能となり、抗原特異的リンパ球の正確な検出率が大幅に改善した。【2】ヒト型抗体が認識するHBs抗原エピトープの決定:B型肝炎ウイルス(HBV)の感染には、HBVのエンベロープ蛋白が関与するが、ヒト抗体が認識できる部位(抗原エピトープ)についての詳細な検討はなされていない。今回、リンパ球チップで作成した多くのHBVに対するヒト型モノクローナル抗体を用いて、抗原エピトープの解析を行った。HBs抗原は226のアミノ酸からなり、抗原決定基aはアミノ酸配列はすでに報告されているので、ポリペプチド(約15アミノ酸)を新たに合成し、各々のペプチドに結合し得る抗体(競合実験を含む)を調べることで、HBV中和能との連関を明らかにすることができた。

This research aims to further improve the "lymphocyte chip," which we have developed in the world for the first time, efficiently identify pathogen-specific human B lymphocytes from the blood of infectious disease patients, rapidly isolate the antibody genes produced by those B lymphocytes, and generate human recombinant antibodies within one week, thereby contributing to the world's fastest infectious disease treatment strategy for biological恐怖主义使用新兴的传染病和细菌。 2009财政年度的研究结果如下。 [1]淋巴细胞尖端的改善：将微阵列扫描仪改进到两荧光兼容类型，并建立了一个系统，以使用两种不同的钙荧光染料来准确检测阳性细胞。我们还使用CCD摄像头开发了新的微阵列扫描仪。也就是说，在抗原刺激之后，每10毫秒每10毫秒拍摄细胞荧光强度，并可以使用计算机分析荧光强度数据。这使得确认淋巴细胞克隆对由抗原浓度，抗原表位数量以及抗原受体的数量，亲和力等定义的细胞刺激强度的反应差异以及抗原特异性淋巴细胞的准确检测率得到了极大的改善。 [2]通过人类抗体识别的HBS抗原表位的测定：HBV的包膜蛋白参与了乙型肝炎病毒（HBV）的感染，但尚未对该位点（抗原表位）进行详细检查，这些检查可以被人类抗体识别。在本文中，使用针对淋巴细胞芯片上许多HBV的人单克隆抗体分析抗原表位。 HBS抗原由226个氨基酸和抗原决定剂A的氨基酸序列组成，因此，通过新合成多肽（约15个氨基酸）的新合成，并检查可以与每种肽结合的抗体（包括竞争实验）结合的抗体（包括竞争实验），可以阐明与HBV中性化的相关性。