次世代マイクロチップを用いた単一リンパ球機能のハイスループット解析法の開発

使用下一代微芯片开发单淋巴细胞功能的高通量分析方法

基本信息

批准号：
20034020
负责人：
村口篤
金额：
$ 4.86万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、我々が世界で初めて開発した「リンパ球チップ」をさらにブラッシュアップし、感染症患者の血液から病原菌特異的なヒトBリンパ球を効率良く同定し、そのBリンパ球が産生する抗体遺伝子を迅速に単離し、ヒト型リコンビンナント抗体を1週間以内に作製することで、新興感染症や細菌を用いた生物テロに対する世界最速の感染症治療戦略に貢献することを目指す。平成21年度の研究実績は以下のとおりである。【1】リンパ球チップの改良:マイクロアレイスキャナーを2蛍光対応型に改良し、2つの異なるカルシウム蛍光色素を用い、正確な陽性細胞の検出する系を確立した。また、CCDカメラを用いた新しいマイクロアレイスキャナーの開発を行った。すなわち、抗原刺激後、10mSec毎、3分間、細胞蛍光強度を撮影し、その蛍光強度のデータをコンピューターで解析することが可能となった。このことで、抗原濃度や抗原のエピトープ数さらに抗原受容体の数や親和性等によって規定される細胞刺激の強弱に対するリンパ球クローンの反応差を確認することが可能となり、抗原特異的リンパ球の正確な検出率が大幅に改善した。【2】ヒト型抗体が認識するHBs抗原エピトープの決定:B型肝炎ウイルス(HBV)の感染には、HBVのエンベロープ蛋白が関与するが、ヒト抗体が認識できる部位(抗原エピトープ)についての詳細な検討はなされていない。今回、リンパ球チップで作成した多くのHBVに対するヒト型モノクローナル抗体を用いて、抗原エピトープの解析を行った。HBs抗原は226のアミノ酸からなり、抗原決定基aはアミノ酸配列はすでに報告されているので、ポリペプチド(約15アミノ酸)を新たに合成し、各々のペプチドに結合し得る抗体(競合実験を含む)を調べることで、HBV中和能との連関を明らかにすることができた。

这项研究进一步完善了我们在全球首次开发的“淋巴细胞芯片”，能够高效识别传染病患者血液中的病原体特异性人B淋巴细胞，并快速检测这些B淋巴细胞产生的抗体。通过在一周内分离基因并生产人源化重组抗体，我们的目标是为世界上最快的传染病治疗策略做出贡献，以应对新出现的传染病和利用细菌的生物恐怖主义。 2009年研究成果如下。 [1] 改进淋巴细胞芯片：我们改进了微阵列扫描仪以支持双荧光，并建立了使用两种不同钙荧光染料精确检测阳性细胞的系统。我们还开发了一种使用 CCD 相机的新型微阵列扫描仪。换句话说，可以在抗原刺激后每10mSec拍摄3分钟的细胞荧光强度，并使用计算机分析荧光强度数据。这使得可以确认淋巴细胞克隆对细胞刺激强度的反应差异，该差异是由抗原浓度、抗原表位数量以及抗原受体的数量和亲和力决定的，从而提高了准确检测率。显著地。 [2] 人抗体识别的HBs抗原表位的测定：HBV包膜蛋白参与乙型肝炎病毒（HBV）感染，但人抗体可识别的位点（抗原表位）的详细情况尚不清楚。给予。这次，我们使用淋巴细胞芯片产生的多种抗 HBV 人单克隆抗体分析了抗原表位。 HBs抗原由226个氨基酸组成，抗原决定簇a的氨基酸序列已被报道，因此，我们合成了一种新的多肽（大约15个氨基酸）并开发了可以与每个肽结合的抗体（包括竞争性实验）。），我们能够阐明与 HBV 中和能力的关系。