ヒト免疫細胞の発生分化に関する分子生物学的研究

人体免疫细胞发育和分化的分子生物学研究

基本信息

批准号：
05272211
负责人：
村口篤
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Toyama Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)ヒト組み換え活性化遺伝子(RAG)発現誘導に関する研究(1)ヒトRAG-1mRNA発現の微量測定法の確立:RT-PCR法によるヒトRAG-1 mRNAの高感度かつ特異的検出法を確立した。この系を用いて、正常細胞・血液系細胞株におけるRAG-1 mRNAの発現を検討したところ、胸腺・骨髄細胞・pre-B株(Nalm-6)・T細胞株(CEM)などの未熟細胞にRAG-1が発現していることが明らかになった。また、我々の樹立した胎児肝由来リンパ球様細胞株(FL)においてはその発現は見られず、FLがRAGを発現する以前の前駆細胞であることが確認された。(2)FL細胞(未熟リンパ球株)のRAG発現誘導:マウス骨髄由来のストローマ細胞株(PA6)、ヒト骨髄由来ストローマ細胞株(RASV-5)をFL細胞を共培養することで、FLにRAG-1 mRNAの発現が誘導された。この発現誘導には、ストローマ細胞との直接接触が必要であること、またある種のサイトカインがこの誘導を増幅することを明らかにした。サイトカインとしては、IL-3,IL-6,IL-7が重要であることを明らかにした。(2)ホメオボックス蛋白の特異的DNA結合配列の決定ホメオボックス遺伝子(HB24)cDNAを用いて、in vitro translation kitでHB24蛋白を合成し、可能性ある全degenerativeオリゴヌクレオチドに対してゲルシフトアッセイを行った。ゲルから結合断片を回収し、PCRにより増幅するという行程を3回繰り返し、シークエンス特異的に結合すると考えられるヌクレオチドプールを得た。これをブルースクリプトベクターを用いてサブクローニングし、大腸菌にトランスフォームして得られたプラスミド(31種類)の塩基配列を決定した。その結果、24種のプラスミドDNAが同一のコンセンサス配列(7塩基配列)を含むことを明らかにした。得られた7塩基配列が特異的結合配列であることは、変異ヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセイにて確認した。

（1）诱导人重组激活基因（RAG）表达的研究（1）建立微量人RAG-1 mRNA表达测定方法：建立高灵敏、特异的人RAG-1 mRNA检测方法RT-PCR方法做到了。利用该系统，我们研究了正常细胞和血细胞系中RAG-1 mRNA的表达，发现未成熟细胞如胸腺、骨髓细胞、前B细胞系（Nalm-6）和T细胞系（CEM） ) 表明 RAG-1 表达于此外，在我们建立的胎儿肝源性淋巴细胞系（FL）中未观察到其表达，证实FL是不表达RAG的前体细胞。 (2) FL细胞（未成熟淋巴细胞系）中RAG表达的诱导：通过将FL细胞与小鼠骨髓源性基质细胞系（PA6）和人骨髓源性基质细胞系（RASV-5）共培养，FL诱导RAG-1 mRNA表达。我们发现，诱导这种表达需要与基质细胞直接接触，并且某些细胞因子会放大这种诱导。据揭示，IL-3、IL-6和IL-7是重要的细胞因子。 (2)同源盒蛋白的特异性DNA结合序列的测定使用同源盒基因(HB24)cDNA，使用体外翻译试剂盒合成HB24蛋白，并对所有可能的变性寡核苷酸Ta进行凝胶位移测定。从凝胶中收集结合片段并通过 PCR 扩增它们的过程重复三次，以获得被认为与序列特异性结合的核苷酸库。使用Bluescript载体对其进行亚克隆，将所得质粒（31种）转化至大肠杆菌中，确定其碱基序列。结果表明，24种质粒DNA含有相同的共有序列（7个碱基序列）。通过使用突变核苷酸的凝胶位移测定证实获得的7-核苷酸序列是特异性结合序列。