蛋白質間相互作用ドメインへのゲノム的アプローチ

蛋白质-蛋白质相互作用域的基因组方法

基本信息

批准号：
12034207
负责人：
伊藤隆司
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12034207/
关键词：
蛋白質相互作用酵母2ハイブリッド法相互作用ドメイン

项目摘要

我々は網羅的2ハイブリッド解析の成果に基づき、そこから相互ドメインを組織的にマッピングする目的で下記の「2ハイブリッドフットプリント法」(2HF)を考案した。まず標的ORFに一方向性に欠失を導入した変異体集団を活性化ドメイン融合ベクター(prey)上で構築、2ハイブリッド選択を行った選択集団と行わない非選択集団とを得る。続いて両集団全体からpreyのインサートをPCR増幅、電気泳動で展開する。非選択集団からは全長インサート断片以下レーン全体に渡るラダーが得られるが、選択集団からのラダーは結合領域の境界までで途切れる。これが2HFの原理である。2HFを行う際に最も問題となるのは、如何に簡便に一方向性に欠失変異を持ったDNA集団を得るかである。我々は組み換えを利用する新規のdeletion by recombination(DBR)法を考案した。DBRではまず標的ORFの例えばN末端部位で切断して得た線状プラスミドとその切断点に隣接するベクター由来の部分(活性化ドメインコード領域)のC末端側にランダム配列を付加した断片とを用意する。次に、両者を同時に酵母に形質転換すると、両者が共有する活性化ドメインコード領域でDNA鎖の乗り換えが起こり、更にランダム配列部分が切断点下流のプラスミド上のどこかと組み換わったプラスミド、つまり切断点と組み換え点の間が様々に欠失したプラスミド、を保持した酵母細胞集団が得られるはずである。このような発想の下、我々はモデル系でDBR現象を確認、更に基本反応条件を確立した。更に、DBRを酵母MAPKカスケードのスキャフォールド蛋白質STE5に実際に応用し、STE11、STE7結合部位の2HFマッピングに成功した。これにより2HFのfeasibilityが示され、その技術基盤が確立した。現在、実用化を目指して反応の至適化を進めている。

基于全面的两个混合分析的结果，我们为系统绘制互域的目的设计了以下“ 2个混合足迹方法”（2HF）。首先，在目标ORF中丢失的突变组是建立在振兴的域融合载体（PREFY）的选择组，而不是执行两种杂交选择的非选择组。然后，通过PCR和电动游泳扩展了整个组的猎物插入物。从非选择的组中，在获得总长度插入片段后越过整个车道的梯子，但来自所选组的梯子被结合区域的边界中断。这是2HF的原理。执行2HF时最有问题的是，以一个方向延迟的DNA组很容易。我们已经设计了使用重组的重组（DB）定律的新删除。在DBR中，通过在N末端部分切割获得的线性质粒，例如，通过N末端部分获得的线性质粒，以及在载体衍生的C末端添加随机序列的片段零件（激活域代码区域）与切割点相邻。接下来，当两者同时转换为酵母时，DNA链转移发生在两者共享的激活域代码区域中，随机阵列部分是质粒，已替换在切割下游的质粒上的某个地方点，也就是说，应该有一个酵母细胞组，其中质粒在点和重组点之间已经丢失了。在这些思想下，我们已经确认了模型系统中的DBR现象，并建立了基本的反应条件。此外，DBR实际上被应用于酵母MAPK级联反应中的鳞片蛋白Ste5，而Ste11和Ste7加入站点的2HF映射成功。结果，显示了2HF的可行性，并建立了其技术基础设施。目前，该反应促进了实际用途。