蛋白質―蛋白質相互作用情報の系統的解析

蛋白质-蛋白质相互作用信息的系统分析

基本信息

批准号：
12206004
负责人：
伊藤隆司
金额：
$ 29.44万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12206004/
关键词：
TAPタグ PAP法 LC MS SH3ドメイン PB1ドメイン保証付き逆2ハイブリッド法ユビキチンプロテオーム 2ハイブリッド法 GIドメイン PBIドメイン PXドメイン蛋白質相互作用酵母2ハイブリッド法相互作用ドメイン

项目摘要

1)抗タグ抗体を用いた複合体精製による相互作用の確認、プロファイリングおよび複合体全体の構成解明を効率的に推進する為に、新規タンデムアフィニティ精製(TAP)タグの開発を行った。変性剤存在下での精製に適用可能なHis6に加えてStrept-tagとFlag-tagを様々な順列で配置したタグを作製し、テスト蛋白質の精製効率から性質のよいものを選択した。これを用いて酵母の全SH3蛋白質遺伝子にタグコード配列をノックインした株を作製、架橋剤存在下での複合体精製とLC/MS/MSによる解析を進めている。2)異なるタグで標識されたユビキチンを同時に発現し、双方のタグに対するアフィニティ精製を連続して行うことで、ポリユビキチン化蛋白質を高純度に精製するパラレルアフィニティタグ精製(PAP)法を開発し、得られた蛋白質のLC/MS/MSによる網羅的同定を行った。同定された蛋白質に関しては個別にユビキチン化を検討して、この方法による検出の正当性を実証した。3)保証付き逆2ハイブリッド法による相互作用変異体の単離法の開発と応用を進めた。その結果、これまで解析が難航していたほ乳類細胞極性蛋白質Par6とaPKCの相互作用や、出芽酵母の細胞極性蛋白質BEM1とCDC42の相互作用の解析に成功し、本法の有効性が実証された。前者は更に我々が見い出したPB1ドメインの認識機構の研究に、後者は新規CDC42結合ドメインの発見へと研究が展開している。これらの経験も踏まえて、保証付き逆2ハイブリッド法を用いて得られた相互作用変異体と同時に相互作用への中立変異体とを配列決定することで相互作用モチーフの同定が効率的に進展できる可能性が示された。

1）我们开发了一种新的串联亲和力改进（TAP）标签（TAP）标签（TAP）标签（TAP）改进（TAP），以便通过使用抗TAG抗体进行完善，并有效地促进互动整个建筑群。除His6外，还准备了在各柱中排列的带有链球标签和标志标签的标签，还准备了His6，还准备了一个标签，并从测试蛋白的纯化效率中选择了良好的性质。使用此方法，制备了在所有SH3蛋白基因上敲打标签代码序列的菌株，并且正在使用交联剂的存在中的复合细化，并使用LC/MS/MS进行分析。 2）开发一种平行的亲和力标签改进（PAP）方法，该方法同时表达由不同标签签名的泛素，并且对两个标签的持续完善的亲和力，以高纯度净化多次精神分裂蛋白。由LC/MS/MS。关于确定的蛋白质，我们考虑了泛素化，并通过该方法证明了检测的合法性。 3）保修逆转2通过混合方法开发了相互作用的隔离方法的开发和应用。结果，对困难的哺乳动物细胞极性极性蛋白PAR6和APKC的分析，以及芽酵母的细胞极蛋白BEM1和CDC42的相互作用，并证明了该定律的有效性。前者正在研究我们发现的PB1结构域的识别机制，后者一直在研究新的CDC42结合结构域。基于这些经验，可以通过使用Reverse 2 Hybrid方法获得保修的相互作用变体，从而有效地开发相互作用基序。