エピジェネティクスの基本動作原理に基づくメチロームの合成

基于表观遗传学基本操作原理的甲基化组合成

基本信息

批准号：
22K19276
负责人：
伊藤隆司
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19276/
关键词：
ゲノム編集 DNAメチル化合成生物学酵母

项目摘要

出芽酵母ゲノム中にメチル化を導入（開始）し、拡張・制限・維持を行うのが本研究の挑戦である。これらを行うためのゲノム領域を出芽酵母ゲノム中に創出するために、λファージゲノム48.5 kbをそっくりそのままho遺伝子座位に挿入することを試みた。具体的には、Cas9によるゲノム編集によって、48.5 kbのλDNAを挿入しようとしたが、所期の成果を得られなかった。そこで48.5 kbを相互にオーバーラップした６つの断片に分けてPCRによって調製し、それらを同時にゲノム編集に用いることを試みた。当初、選択を容易にするべく栄養選択マーカーを持たせた形で実施して、６断片が想定された順番通りに挿入されたことを示す結果が得られた。更に、条件を最適化したところ、選択マーカーなしでのλDNAの挿入にも成功したことが示唆された。最終的には、ナノポアシーケンシングを行って、所期の通りにλDNAをゲノム中に挿入できたことを確認した。更に、導入したDNAメチル化の維持を行うために、維持メチル化酵素DNMT5の人工遺伝子の合成を行い、それらを発現する株の作成を進行中である。これらのゲノム改変を効率的に進めるために、以前に開発した遺伝子編集プラスミドシリーズを拡張し、３遺伝子座の同時編集も高い効率で進める系を確立した。

这项研究的挑战是在细菌酵母基因组期间引入（开始）甲基化（开始），并扩展，限制和维持。为了创建用于在胚芽酵母基因组中执行这些区域的基因组区域，我们试图将λfurgenom48.5 kb插入HO基因坐姿。具体而言，CAS9的基因组编辑试图插入48.5kbλdna，但没有得到结果。因此，我们试图将48.5 kb分成六个用相互PCR重叠的片段，并尝试同时将其用于基因组编辑。最初，结果表明，六个片段是按照假定顺序插入的，并用营养选择标记实现，以使选择更容易。此外，当对条件进行优化时，建议在没有选择标记的情况下插入λDNA是成功的。最终，我们进行了纳米孔测序，并确认可以像在此期间一样将λDNA插入基因组中。此外，为了维持引入的DNA甲基化，正在合成维持甲基化酶DNMT5的人工基因，表达它们的菌株正在发展。为了有效地促进这些基因组修饰，已经扩展了先前开发的遗传编辑质粒系列，并建立了一个系统以促进高效效率的三个基因的同时编辑。