ストレス応答のシステム生物学:出芽酵母GCN経路のリアルタイム計測

应激反应的系统生物学：酿酒酵母 GCN 通路的实时测量

基本信息

批准号：
16651095
负责人：
伊藤隆司
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16651095/
关键词：
アミノ酸センサー FRET HisJ EYFP ECFP

项目摘要

本研究の目的は、ストレス応答のシステム生物学的解析への第一歩として、出芽酵母の栄養ストレス応答を制御するGCNパスウェイの挙動をリアルタイムに計測できる実験系を構築することにある。具体的には、GCN経路の出力である細胞質内のアミノ酸濃度の実時間計測を行なうことを目指して、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を利用したセンサーの開発に取り組んだ。センサーの骨格としては、大腸菌のペリプラズム結合蛋白質HisJを用いた。HisJは2つのローブからなる蛋白質で、ヒスチジンと結合すると、コンフォメーションの変化が起こり、ローブの位置関係が変化する。そこでN末とC末に黄色蛍光蛋白質YFPとシアン蛍光蛋白質CFPを付加しておくと、FRETの変化が起こると期待される。この考えに基づいて、YFP-HisJ-CFPを作成したところ、ヒスチジンの添加とともにFRETが減少してゆくセンサーを開発することに成功した。更に細胞質内のヒスチジン濃度に合致したKdを持つように変異を導入したところ、Glnに対しても親和性を持つことが判明した。そこで、ドッキングシミュレーションを用いてGlnの結合様式を予測し、それに基づく変異導入でGlnには殆ど結合せず、生理的な濃度のHisに応答できるセンサーの開発に成功した。このセンサーを用いて倍地中のHisの変化に応じた細胞質Hisの変化の計測に成功した。しかしながら、内因性の蛍光物質が培地中に蓄積することから、培養液そのものを用いた蛍光計測が困難である。現在、これを回避する為に励起-蛍光波長が長波長側にずれたセンサーの開発を試みている。

这项研究的目的是建立一个实验系统，该系统可以衡量GCN通道的行为，该系统可以实时控制芽酵母的营养应激反应，这是压力反应系统生物学分析的第一步。具体而言，我们使用荧光共振能（FRET）来开发传感器，旨在测量大细胞基因氨基酸浓度的实际时间，即GCN路线的输出。作为传感器的骨骼，使用了大肠杆菌的质结合蛋白HISJ。 HISJ是一种由两种长袍组成的蛋白质，当与组氨酸结合使用时，抗性变化和长袍的位置关系会发生变化。因此，预计如果将黄色荧光蛋白YFP和青色荧光蛋白CFP添加到N和C的末端，则会发生FRET的变化。基于这个想法，当创建YFP-HISJ-CFP时，我们成功地开发了一个传感器，在该传感器中，随着组氨酸的添加，FRET降低了。此外，引入了一个突变具有与细胞质中组氨酸水平相匹配的KD，发现GLN具有亲和力。因此，我们成功地开发了一种传感器，该传感器使用对接模拟来预测GLN的结合样式，并且基于突变体引入几乎没有与GLN的结合。使用该传感器，我们成功地根据双层地面的变化来衡量细胞源的变化。但是，由于内源性荧光物质在培养基中积累，因此很难使用培养溶液本身测量荧光。当前，令人兴奋的是避免这种情况 - 试图开发一种将长荧光波长转移到长波长侧的传感器。