がん関連遺伝子候補としてのインプリント遺伝子の網羅的単離

全面分离印迹基因作为癌症相关候选基因

基本信息

批准号：
12213032
负责人：
伊藤隆司
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12213032/
关键词：
インプリンティング DNAメチル化 CpGアイランド

项目摘要

哺乳類ゲノム中はどちらか一定の親から受け継いだアレルしか発現しないインプリント遺伝子が存在し、発がんにおいてもその役割が注目されている。そこで我々はがん関連遺伝子としてのインプリント遺伝子の網羅的同定を目指して以下の2つのアプローチをとってきた。一つは転写物中の多型cSNPを利用するもので我々が独自に開発したアレリックメッセージディスプレイ法を利用するものである。本法には母性発現遺伝子とミトコンドリア転写物との識別が煩雑という欠点があったが、核移植によって亜種でありながら同一のミトコンドリアを持つマウスを準備しこの問題を克服した。この系統を用いたスクリーニングが進行中で既に20余りの候補cDNAバンドを得て解析を進めている。もう一方はゲノム配列からインプリント遺伝子に特徴的な反復構造を持つCpGアイランドを同定し、近傍遺伝子を候補として解析する戦略である。ヒトゲノムドラフト配列から抽出したCpGアイランドをHerrプロットにかけ縦列反復構造を保持したものを選択、メチル化感受性制限酵素HpaII消化とPCRによる解析を行ったところ、予想外にもこのタイプのアイランドの多くが正常組織中でも完全にメチル化されていた。そこで片側アレルのみがメチル化されたアイランドを効率的に同定する為にメチル化特異的制限酵素McrBCを併用するHpaII-McrBC PCR法を考案した。この方法でImpact遺伝子全域のメチル化をスキャンした結果、プロモータと第1イントロンは母親由来アレルのみがメチル化されるがそれ以外の領域では両アレルともメチル化されることが迅速に示され、本法の有効性が実証された。現在、これを用いたCpGアイランドメチル化の系統的解析に着手した。

在哺乳动物基因组中，存在仅在遗传自父母之一的等位基因中表达的印记基因，它们在致癌作用中的作用也引起人们的关注。因此，我们采取了以下两种方法，旨在全面鉴定印记基因为癌症相关基因。一是利用转录本中的多态性cSNP，这是我们最初开发的一种等位基因信息显示方法。尽管这种方法的缺点是区分母体表达的基因和线粒体转录本很复杂，但我们通过核移植制备具有相同线粒体（尽管是亚种）的小鼠，克服了这个问题。该菌株的筛选正在进行中，已经获得了 20 多个候选 cDNA 条带，分析正在进行中。另一种策略是从基因组序列中识别具有印迹基因重复结构特征的 CpG 岛，然后分析邻近基因作为候选基因。从人类基因组草图序列中提取的CpG岛进行Herr图，并选择那些保留串联重复结构的岛，当用甲基化敏感的限制性酶HpaII消化和PCR进行分析时，出乎意料的是，许多此类岛被选中。发现它在组织中也完全甲基化。因此，为了有效地识别仅一个等位基因甲基化的岛，我们设计了HpaII-McrBC PCR方法，该方法使用甲基化特异性限制酶McrBC。使用这种方法扫描整个Impact基因的甲基化，我们很快证明只有启动子和第一个内含子中的母体等位基因被甲基化，但在其他区域两个等位基因都被甲基化，该规律的有效性得到了证明。我们现在已经开始使用这种方法对 CpG 岛甲基化进行系统分析。