生きた細胞で代謝調節を視覚化する技術

活细胞代谢调节可视化技术

基本信息

批准号：
18651094
负责人：
伊藤隆司
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

S-adenosylmethionine(SAM)は生体分子への主要なメチル基供与体であり、非常に多くの代謝経路に関与する重要な代謝物である。SAMの動態解析から、代謝調節や細胞周期等の動態をより深く理解するための重要な基礎的知見が得られるど期待されている。食品・醸造産業ではSAMの高生産が重要な課題とされており、その動態解析には応用面からの要望も高い。しかし、SAMは不安定な化合物であり、分析化学的手法による計測が困難である。計測できたとしても細胞の破砕を伴うことから連続的にリアルタイムで計測するまでには至っていない。そこで非破壊的計測が可能なシステムの構築を試みた。SAMセンサー部分としてはSAMをコリプレッサーとする大腸菌のDNA結合蛋白質MetJを利用し、MetJにVP16転写活性化ドメインおよび蛍光蛋白質Venusを連結したセンサーレポーター分子をデザインし、この遺伝子をmetオペレーターの下流に挿入した。細胞内SAM濃度が上昇すると、このセンサーレポーターにSAMが結合し、metオペレーターへの親和性が増大する。その結果、自身をコードする遺伝子の発現を上昇させるというポジティブフィードバックが作用する。このフィードバックの作用はVenusの蛍光強度変化として検出することができる。この蛍光を測定することにより細胞内SAM濃度の動態を追跡できる。この系で、実際に培地中Met濃度変化や代謝経路の変異による細胞内SAMの変化の検出に成功した。

S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 是生物分子的主要甲基供体，也是参与多种代谢途径的重要代谢物。 SAM 动力学分析有望为更深入地理解代谢调节和细胞周期等动力学提供重要的基础知识。 SAM的高产量是食品和酿造行业的一个重要问题，从应用角度对其动态分析有很高的要求。然而，SAM 是一种不稳定的化合物，很难使用分析化学方法进行测量。即使可以测量它，也不可能实时连续测量它，因为这会破坏细胞。因此，我们试图构建一个可以执行无损测量的系统。作为SAM传感器部分，我们使用了大肠杆菌DNA结合蛋白MetJ，该蛋白以SAM为辅阻遏物，设计了一种传感器报告分子，其中MetJ与VP16转录激活结构域和荧光蛋白Venus连接，这基因被放置在met操作符的下游。随着细胞内 SAM 浓度的增加，SAM 与该传感器报告基因结合并增加其与 met 操纵子的亲和力。结果，出现了正反馈效应，增加了编码基因本身的表达。这种反馈效应可以通过金星荧光强度的变化来检测。通过测量这种荧光，可以追踪细胞内 SAM 浓度的动态。使用该系统，我们实际上成功地检测到由于培养基中 Met 浓度的变化和代谢途径突变而导致的细胞内 SAM 的变化。