生体内遊離ヘムの計測と細胞内イメージング

体内游离血红素测量和细胞内成像

基本信息

批准号：
18K05358
负责人：
坂本寛
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Kyushu Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K05358/
关键词：
ヘムセンサープローブ FRET イメージング酵素ケミカルバイオロジー

项目摘要

ヘムは生体に必須の色素であり，一部のヘムは細胞内で遊離ヘムとして存在する。遊離ヘムは生体に様々な影響を与えることが知られており，高濃度域では疾患の原因となることが明らかにされている。これまでに，ヘム分解系酵素であるヘムオキシゲナーゼ1（HO1）とNADPHシトクロムP450還元酵素のopen型変異体（ΔTGEE）にそれぞれ緑色蛍光蛋白質の変異体である青色蛍光蛋白質（CFP）と黄色蛍光蛋白質（YFP）を修飾した，蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づく一分子型バイオセンサーCFP-HO1-ΔTGEE-YFPを開発した。このセンサーでは，HO1に結合したヘムにCFPの蛍光エネルギーが吸収される可能性があること，蛋白質間相互作用によらないFRETが生じている可能性があること，分子量が大きく可溶化しにくいことが問題であった。今年度は，これらの課題を解決するためにCFPとYFPの修飾位置を交換し，さらにHO1-ΔTGEE間のリンカーを欠損させた二分子型FRETバイオセンサーYFP-HO1/ΔTGEE-CFPを開発することとした。YFP-HO1およびΔTGEE-CFPをそれぞれ大腸菌発現系を用いて発現・単離した。50 nMのYFP-HO1とΔTGEE-CFPの混合溶液にCFPの励起光（385 nm）を照射し，ヘムを0から75 nMまで添加しながら蛍光スペクトルを測定したところ，YFPの蛍光（525 nm）の上昇が見られ，FRETが観測された。ヘム濃度に対しFRETシグナルの強度変化をプロットした結合曲線より，2.2 nMの解離定数が算出された。また，沈降平衡法を用いた超遠心分析により，ヘム結合型YFP-HO1とΔTGEE-CFPが複合体を形成することが確認された。これらのことより，YFP-HO1とΔTGEE-CFPは，二分子間FRETヘムセンサーとして機能することが示された。

血红素是生物生物的必不可少的色素，并且在细胞中以游离血液的形式存在一些血红素。众所周知，自由血红素对生物体有各种影响，并且已被证明是高浓度的疾病原因。到目前为止，我们已经开发了一种基于荧光共振能传递（FRET）的单个分子生物传感器CFP-HO1-ΔTGEE-YFP，该偶然性共振能量转移（FRET）已通过血红素降解酶的开放式突变体（ΔTgee）修饰，其血红素酶的血红素氧酶1（HO1）和NADPH细胞染料酶（NADPH P450 REALE）（HOE1）和NADPH P450还原酶（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）。该传感器有可能吸收与HO1结合的血红素中CFP的荧光能，这不是由蛋白质蛋白质相互作用引起的，并且很难溶解。今年，我们决定开发双分子的FRET生物传感器YFP-HO1/ΔTGEE-CFP，以通过替换CFP和YFP的修饰位置以及在HO1-ΔTGEE之间删除链接来解决这些问题。 YFP-HO1和ΔTgee-CFP分别使用大肠杆菌表达系统表达和分离。当用CFP的激发光（385 nm）的激发光照射YFP-HO1和ΔTGEE-CFP的50 nm混合溶液时，并在将血红素从0到75 nm添加到75 nm时测量荧光谱，观察到YFP（525 nm）的荧光增加，并观察到FRET的荧光。从结合曲线计算出2.2 nm的解离常数，该曲线绘制了FRET信号相对于血红素浓度的强度变化。此外，使用沉积平衡方法的超级离心分析证实，血红素结合的YFP-HO1和Δtgee-CFP形成了复合物。这些结果表明，YFP-HO1和ΔTgee-CFP充当了米型分子fret血红素传感器。