生体内遊離ヘムの計測と細胞内イメージング

体内游离血红素测量和细胞内成像

基本信息

批准号：
18K05358
负责人：
坂本寛
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Kyushu Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K05358/
关键词：
ヘムセンサープローブ FRET イメージング酵素ケミカルバイオロジー

项目摘要

ヘムは生体に必須の色素であり，一部のヘムは細胞内で遊離ヘムとして存在する。遊離ヘムは生体に様々な影響を与えることが知られており，高濃度域では疾患の原因となることが明らかにされている。これまでに，ヘム分解系酵素であるヘムオキシゲナーゼ1（HO1）とNADPHシトクロムP450還元酵素のopen型変異体（ΔTGEE）にそれぞれ緑色蛍光蛋白質の変異体である青色蛍光蛋白質（CFP）と黄色蛍光蛋白質（YFP）を修飾した，蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づく一分子型バイオセンサーCFP-HO1-ΔTGEE-YFPを開発した。このセンサーでは，HO1に結合したヘムにCFPの蛍光エネルギーが吸収される可能性があること，蛋白質間相互作用によらないFRETが生じている可能性があること，分子量が大きく可溶化しにくいことが問題であった。今年度は，これらの課題を解決するためにCFPとYFPの修飾位置を交換し，さらにHO1-ΔTGEE間のリンカーを欠損させた二分子型FRETバイオセンサーYFP-HO1/ΔTGEE-CFPを開発することとした。YFP-HO1およびΔTGEE-CFPをそれぞれ大腸菌発現系を用いて発現・単離した。50 nMのYFP-HO1とΔTGEE-CFPの混合溶液にCFPの励起光（385 nm）を照射し，ヘムを0から75 nMまで添加しながら蛍光スペクトルを測定したところ，YFPの蛍光（525 nm）の上昇が見られ，FRETが観測された。ヘム濃度に対しFRETシグナルの強度変化をプロットした結合曲線より，2.2 nMの解離定数が算出された。また，沈降平衡法を用いた超遠心分析により，ヘム結合型YFP-HO1とΔTGEE-CFPが複合体を形成することが確認された。これらのことより，YFP-HO1とΔTGEE-CFPは，二分子間FRETヘムセンサーとして機能することが示された。

血红素是生物体必需的色素，一些血红素以游离血红素存在于细胞内。众所周知，游离血红素对生物体有多种影响，并且已经证明高浓度会导致疾病。到目前为止，我们已经开发出了血红素降解酶血红素加氧酶1（HO1）和NADPH细胞色素P450还原酶的开放突变体（ΔTGEE），以及蓝色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（它们是NADPH细胞色素P450还原酶的突变体）。我们分别开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）修饰的单分子生物传感器CFP-HO1-ΔTGEE-YFP。在该传感器中，CFP的荧光能量可能被与HO1结合的血红素吸收，可能发生FRET，这不是由于蛋白质-蛋白质相互作用，并且分子量大且难以溶解是问题。今年，为了解决这些问题，我们将开发一种双分子FRET生物传感器，YFP-HO1/ΔTGEE-CFP，其中CFP和YFP的修饰位置被交换，HO1和ΔTGEE之间的连接子被删除等。 YFP-HO1 和 ΔTGEE-CFP 均使用大肠杆菌表达系统进行表达和分离。当用CFP激发光(385nm)照射50nM YFP-HO1和ΔTGEE-CFP的混合溶液并在添加0至75nM的血红素的同时测量荧光光谱时，测量了YFP的荧光(525nm)。观察到 FRET 增加。根据结合曲线计算出 2.2 nM 的解离常数，其中根据血红素浓度绘制 FRET 信号强度的变化。此外，使用沉降平衡法的超速离心分析证实，血红素结合的YFP-HO1和ΔTGEE-CFP形成复合物。这些结果表明 YFP-HO1 和 ΔTGEE-CFP 作为双分子 FRET 血红素传感器发挥作用。