核多角体病ウイルスの宿主域決定機構の解析

核型多角体病毒宿主范围决定机制分析

基本信息

批准号：
04J05964
负责人：
石川裕規
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

マイマイガ由来のLd652Y細胞で増殖可能なLdMNPVのゲノムに特異的にコードされるHRF-1は、Ld652Y細胞で増殖不可能なAutographa californica MNPV (AcMNPV)の増殖を促進する因子として同定された。我々はこれまでに、HRF-1は、AcMNPVだけではなくNPV一般のLd652Y細胞における増殖に必須な因子であること、ならびにNPV感染により誘導される抗ウイルス応答である全タンパク質合成停止を排除することを示した。本研究では、HRF-1による全タンパク質合成停止排除の分子機構の理解を目的とし、HRF-1と相互作用する因子の探索を行なった。HRF-1の全長をbaitとした酵母two-hybrid法により、Ld652Y細胞のcDNAライブラリーから、HRF-1と結合する細胞因子を探索した。その結果、翻訳開始因子eIF3のサブユニット10(Ld-eIF3a)の部分cDNAを得た。RACE法によりLd-eIF3aの全長cDNAの塩基配列を決定したところ、Ld-eIF3aは1199アミノ酸からなり、他の生物種のeIF3aと高い相同性を示した。同定した全長Ld-eIF3aをHRF-1と共にLd652Y細胞で強制発現させ、免疫沈降を行った結果、Ld652Y細胞でHRF-1とLd-eIF3aとの結合が示された。そこで、Ld-eIF3aの翻訳開始での役割を知るため、RNAi法により、Ld-eIF3a発現を抑制したLd652Y細胞での翻訳活性を調べた。その結果、Ld-eIF3a発現を抑制したLd652Y細胞では、レポーター遺伝子EGFPの翻訳が著しく阻害された。以上の結果は、Ld-eIF3aがLd652Y細胞での翻訳に必須な役割を果たすことを示し、HRF-1がLd-eIF3aと相互作用することで翻訳開始のイベントに関わることを示唆する。

HRF-1（特别在LDMNPV的基因组中编码）可以在LD652Y细胞中从山药飞蛾中增殖，被鉴定为促进Autographa californica MNPV（ACMNPV）增殖的因素，可以在LD652Y细胞中繁殖。到目前为止，我们已经表明，HRF-1不仅是ACMNPV的增殖的重要因素，而且在NPV中也是消除总蛋白质合成停滞，这是NPV感染引起的抗病毒反应。在这项研究中，我们旨在了解HRF-1诱导的总蛋白质合成消除的分子机制，并搜索与HRF-1相互作用的因素。通过酵母两杂交方法从LD652Y细胞的cDNA库中搜索与HRF-1结合的细胞因子，该方法使用HRF-1的全长是诱饵。结果，获得了翻译起始因子EIF3的亚基10（LD-EIF3A）的部分cDNA。 LD-EIF3A的全长cDNA的核苷酸序列由种族方法确定，LD-EIF3A由1199个氨基酸组成，并与其他物种的EIF3A表现出很高的同源性。鉴定出的全长LD-EIF3A与HRF-1一起被迫在LD652Y细胞中表达，并进行了免疫沉淀，并在LD652Y细胞中显示了HRF-1与LD-EIF3A的结合。因此，为了找出LD-EIF3A在翻译启动中的作用，我们研究了通过RNAi方法抑制LD-EIF3A表达的LD652Y细胞中的翻译活性。结果，在抑制LD-EIF3A表达的LD652Y细胞中，报告基因EGFP的翻译显着抑制。以上结果表明，LD-EIF3A在LD652Y细胞中的翻译中起着至关重要的作用，这表明HRF-1与LD-EIF3A相互作用，并且参与了翻译起始。