核多角体病ウイルスの宿主域決定機構の解析

核型多角体病毒宿主范围决定机制分析

基本信息

批准号：
04J05964
负责人：
石川裕規
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

マイマイガ由来のLd652Y細胞で増殖可能なLdMNPVのゲノムに特異的にコードされるHRF-1は、Ld652Y細胞で増殖不可能なAutographa californica MNPV (AcMNPV)の増殖を促進する因子として同定された。我々はこれまでに、HRF-1は、AcMNPVだけではなくNPV一般のLd652Y細胞における増殖に必須な因子であること、ならびにNPV感染により誘導される抗ウイルス応答である全タンパク質合成停止を排除することを示した。本研究では、HRF-1による全タンパク質合成停止排除の分子機構の理解を目的とし、HRF-1と相互作用する因子の探索を行なった。HRF-1の全長をbaitとした酵母two-hybrid法により、Ld652Y細胞のcDNAライブラリーから、HRF-1と結合する細胞因子を探索した。その結果、翻訳開始因子eIF3のサブユニット10(Ld-eIF3a)の部分cDNAを得た。RACE法によりLd-eIF3aの全長cDNAの塩基配列を決定したところ、Ld-eIF3aは1199アミノ酸からなり、他の生物種のeIF3aと高い相同性を示した。同定した全長Ld-eIF3aをHRF-1と共にLd652Y細胞で強制発現させ、免疫沈降を行った結果、Ld652Y細胞でHRF-1とLd-eIF3aとの結合が示された。そこで、Ld-eIF3aの翻訳開始での役割を知るため、RNAi法により、Ld-eIF3a発現を抑制したLd652Y細胞での翻訳活性を調べた。その結果、Ld-eIF3a発現を抑制したLd652Y細胞では、レポーター遺伝子EGFPの翻訳が著しく阻害された。以上の結果は、Ld-eIF3aがLd652Y細胞での翻訳に必須な役割を果たすことを示し、HRF-1がLd-eIF3aと相互作用することで翻訳開始のイベントに関わることを示唆する。

HRF-1 是在 LdMNPV 基因组中特异编码的，可以在来自吉普赛蛾的 Ld652Y 细胞中生长，它被鉴定为促进不能在 Ld652Y 细胞中生长的苜蓿银纹夜蛾 MNPV (AcMNPV) 生长的因子。我们之前已经证明，在 Ld652Y 细胞中，HRF-1 不仅是 AcMNPV 增殖的重要因素，而且也是 NPV 增殖的重要因素，并且它消除了 NPV 感染诱导的整体蛋白质合成停滞。在这项研究中，我们寻找与 HRF-1 相互作用的因子，目的是了解 HRF-1 关闭和消除总蛋白质合成的分子机制。采用酵母二杂交法，以全长HRF-1为诱饵，从Ld652Y细胞的cDNA文库中寻找与HRF-1结合的细胞因子。结果，获得翻译起始因子eIF3(Ld-eIF3a)的亚基10的部分cDNA。采用RACE法对Ld-eIF3a的全长cDNA进行测序，发现Ld-eIF3a由1199个氨基酸组成，与其他物种的eIF3a具有较高的同源性。将鉴定出的全长Ld-eIF3a与HRF-1一起在Ld652Y细胞中强制表达，并进行免疫沉淀，结果在Ld652Y细胞中证实了HRF-1和Ld-eIF3a之间的结合。因此，为了了解Ld-eIF3a在翻译起始中的作用，我们研究了通过RNAi方法抑制Ld-eIF3a表达的Ld652Y细胞中的翻译活性。结果，在Ld-eIF3a表达被抑制的Ld652Y细胞中，报告基因EGFP的翻译被显着抑制。这些结果表明，Ld-eIF3a 在 Ld652Y 细胞的翻译中发挥重要作用，并表明 HRF-1 通过与 Ld-eIF3a 相互作用参与翻译起始事件。