除去修復エンドヌクレアーゼの機能とその欠損による分子病態に関する研究

切除修复核酸内切酶的功能及其缺陷引起的分子病理学研究

基本信息

批准号：
10165206
负责人：
松永司
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヌクレオチド除去修復(NER)において、XPGとXPF-ERCC1はそれぞれ損傷の3′側と5′側の切断酵素として働くが、XPGやERCC1をノックアウトしたマウスはいづれも成長阻害、離乳前死亡というNER欠損だけでは説明できない重篤な症状を示す。また、XPGはXPF-ERCC1による5′側切断にも関与している可能性が示唆されており、本研究ではXPGの除去修復エンドヌクレアーゼとしての機能以外の役割に注目した。1. Two-hybridシステムを用いた解析より、XPGとERCC1の相互作用が示唆された。プルダウンアッセイを用いて試験管内で確認したところ、バキュロウィルス高発現系から精製されたリコンビナントタンパクや試験管内転写/翻訳反応により合成されたタンパクで両者の相互作用が確認できた。また、その相互作用ドメインのマッピングを行い、XPGはN末とC末の2箇所(主にN末)にERCC1はN末の領域に特定できた。本研究で示されたXPGとERCC1との相互作用は、XPF-ERCC1の損傷部位へのリクルートに関与しているのかもしれない。2. XPGタンパクはNERとは別の修復機構である塩基除去修復(BER)にも関与する可能性が示唆されており、この点について検討した。まず、ウラシルを1個のみ含むDNA基質を用いて塩基除去修復の試験管内切断反応系を確立した。これを用いて各種細胞粗抽出液の切断活性を比較したところ、XP-G患者由来細胞や放医研の塩見らによって樹立されたxpgノックアウトマウス由来細胞の抽出液は、正常細胞に比べて常に低い切断活性(50-80%)を示すことがわかった。また、この低切断活性はウラシルDNAグリコシラーゼの反応効率の低下に起因していた。しかし、リコンビナントXPGを反応系に添加しても相補されず、XPGの塩基除去修復への関与は間接的なものであることが示唆された。

在核苷酸切除修复（NER）中，XPG和XPF-ERCC1分别在病变的3'和5'侧充当裂解酶，但XPG或ERCC1敲除的小鼠表现出NER缺陷，例如生长抑制和断奶前死亡表现出仅凭此无法解释的严重症状。也有人提出 XPG 可能参与 XPF-ERCC1 的 5' 切割，在本研究中，我们重点关注 XPG 除了其作为切除修复核酸内切酶的功能之外的作用。 1. 使用双杂交系统的分析表明 XPG 和 ERCC1 之间存在相互作用。当使用 Pull-down 测定在体外证实时，通过从杆状病毒高表达系统纯化的重组蛋白和通过体外转录/翻译反应合成的蛋白证实了两者之间的相互作用。我们还绘制了它们的相互作用域，并能够在两个位置识别 XPG：N 端和 C 端（主要是 N 端），以及 N 端区域的 ERCC1。本研究中证明的 XPG 和 ERCC1 之间的相互作用可能与 XPF-ERCC1 募集到损伤部位有关。 2. 有人提出，XPG蛋白也可能参与碱基切除修复（BER），这是一种不同于NER的修复机制，我们对此进行了研究。首先，我们使用仅含有一个尿嘧啶的DNA底物建立了用于碱基切除修复的体外裂解反应系统。当我们使用此比较各种粗细胞提取物的裂解活性时，我们发现来自 XP-G 患者的细胞的提取物和来自 Shiomi 等人建立的 XPG 敲除小鼠的细胞的提取物显示出活性（50-80%）。）。此外，这种低切割活性是由于尿嘧啶DNA糖基化酶的反应效率降低造成的。然而，即使将重组XPG添加到反应体系中，也没有发生互补，这表明XPG参与碱基切除修复是间接的。