ヌクレオチド除去修復反応を調節する細胞内因子の解析

调节核苷酸切除修复反应的细胞内因子分析

基本信息

批准号：
09253215
负责人：
松永司
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、高度に精製されたタンパクを用いてヌクレオチド除去修復(NER)反応が試験管内で再構成された。単純化した試験管内系の特徴を生かして基本的NER反応の詳細な作用機構を解明していく一方で、細胞内における他のDNA代謝機構との共存・協調のメカニズムや細胞内の様々なネットワークの中で働くための調節機構を明らかにする必要がある。本研究では、NER機構と相互作用し、基本的NER反応を正、あるいは負に調節する細胞内因子を同定・単離することを目的とした。本年度はまずアッセイ系の確立、および材料の調製を試みた。1.NERの試験管内アッセイ系をスクリーニング系として用いるために、^<32>P標識を必要としない非RIの簡便なアッセイシステムの開発を試みた。蛍光物質をDNA損傷と見立て特定部位に導入した基質DNAを用いることによって、RIで標識することなく損傷を直接蛍光で追跡することが可能となった。また、作製した基質DNAは長期保存が可能となり、再現性の高い系として期待される。問題点として、RIを使用した場合に比べて検出感度が劣ることが挙げられるが、現在基質DNAのデザインの改善などいくつかの改良を行っている。2.再構成系の確立のために、種々のNER因子をリコンビナントタンパクとして調製する必要があり、各遺伝子をバキュロウィルス/昆虫細胞発現用ベクターにサブクローニングし、最終的にリコンビナントウィルスを得た。現在までにXPG、XPA、XPF-ERCC1、およびXPC-hHR23Bが得られ、XPGはすでにリコンビナントタンパクとして精製された。3.各NER因子に対するモノクローナル抗体の樹立を目指し、まずMBP-XPG融合タンパクを免疫原としてマウスを免疫し、XPGに対するモノクローナル抗体4種を作製した。またERCC1とXPFに対するモノクローナル抗体の作製も現在進行している。

近年来，在试管中重建了核苷酸的去除修复（NER）反应（NER）反应（NER）反应（NER）反应（NER）。通过利用简化的试管来阐明基本NER反应的详细动作机制，各种网络以及与其他DNA代谢机制的共存和协调的机制。。在这项研究中，目的是识别和孤立的细胞因子与NER机制相互作用，并对基本的NER反应进行积极或负面的调整。今年，我们首先试图建立一个测定系统并准备材料。 1。为了在试管中使用测定系统作为筛选系统，我们试图开发一个不需要^<32> p符号的非RI的简单测定系统。通过使用被认为被认为是DNA损伤和特定位点的底物DNA，可以直接通过荧光直接跟踪损伤而不会标记为RI。此外，生产的底物DNA可以长时间储存，并有望成为高度可重复的系统。问题在于检测灵敏度不如使用RI，但是目前正在进行一些改进，例如改善底物DNA的设计。 2。为了建立重建系统，需要作为重组蛋白制备各种NER因子，并且每个基因都属于真空病毒/昆虫细胞表达载体，并最终获得了重组病毒。迄今为止，已经获得了XPG，XPA，XPF-ERCC1和XPC-HR23B，并且已经将XPG改进为重组蛋白。 3。旨在建立每个NER因子的单克隆抗体，首先通过MBP-XPG融合蛋白作为免疫原给小鼠免疫，并形成了四种XPG的单克隆抗体。 ERCC1和XPF的单克隆抗体的产生目前正在进行中。