DNA修復関連因子を利用したDNA損傷検出系の開発

利用DNA修复相关因素开发DNA损伤检测系统

基本信息

批准号：
11878091
负责人：
松永司
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)リコンビナント修復関連因子の調製と各因子に対するモノクローナル抗体の作製当初、本研究で使用する修復関連因子としてDNA末端に結合するKu抗原、ミスマッチ塩基対に結合するMutS、バブルやループ構造に特異的に切断を入れるXPGやXPF-ERCCI等を想定したが、今年度はXPG,XPF-ERCC1に加えて、ヌクレオチド除去修復のDNA損傷結合因子であるXPA、XPC-hHR23Bをリコンビナントタンパクとして調製した(MutSは市販)。XPA以外は全てバキュロウィルス/昆虫細胞高発現系を利用し、XPA、XPF、ERCC1にはヒスチジン(His)のタグを付けた。一方、各因子に対するモノクローナル抗体は、抗XPGと抗ERCC1抗体(2種ずつ)を昨年度までに、抗XPA(3種)と抗XPC(1種)抗体を今年度新たに樹立した(抗His抗体は市販)。2)キャピラリー電気泳動法を用いたDNA損傷検出系の開発本研究では、修復関連因子とそれらに対する特異抗体、ならびにキャピラリー電気泳動装置を利用したDNA損傷検出系の開発を目指した。そこでまず、これまでに作製したシクロブタン型ピリミジン二量体に対するTDM-2モノクローナル抗体を利用して条件設定を試みた。紫外線(0-10J/m^2)を照射された細胞から抽出したDNA(熱変性したもの)をTDM-2抗体、Alexa^<TM>488で標識された抗マウスIgG(H+L)2次抗体と反応させた後、ノンコテーィリングシリカキャピラリーで分離した。488nmのアルゴンイオンレーザーで2次抗体の蛍光を検出したところ、DNA-TDM-2抗体-2次抗体の複合体に由来すると思われるピークが検出され、その面積は紫外線線量に依存して増加した。本年度は抗体を用いた予備実験しかできなかったが、キャピラリー電気泳動法を用いてDNA損傷を検出できる見通しが立ったため、今後は調製した各種修復関連因子と抗体を利用することにより、様々なDNA損傷の検出系へと応用していく予定である。

1）准备每个因子的重新覆盖因子和单克隆抗体的产生，KU抗原与DNA结合，作为本研究中使用的修复相关因子，MUTS，与不匹配碱基，气泡和环结构结合XPG和XPF-ERCCI等已分配给，但是除XPG，XPF-ERCC1，XPA和XPC-HR23B外，今年是去除核苷酸的DNA损伤因子，还以重组蛋白（MUT）制备了DNA损伤因子。可商购）。除XPA外，使用了真空病毒/昆虫细胞的所有高表达，XPA，XPF和ERCC1都用组氨酸（HIS）标记。另一方面，每种因子的单克隆抗体具有抗-XPG和抗-ERCC1抗体（每种两种类型），该抗体于去年均具有新建立的抗-XPA（3种类型）和抗-XPC（1型）抗体（1型）抗体年（抗-His抗体（抗-His抗体）。可商购）。 2）使用毛细管电动游泳方法开发DNA损伤检测系统，旨在使用维修相关因子和特定的抗体开发DNA损伤检测系统，以及使用毛细管电子游泳设备的DNA损伤检测系统。因此，首先，我们尝试使用Cyclobutan型吡啶胺双体的TDM-2单克隆抗体来设置条件。从用紫外线（0-10J/m^2）辐照的细胞中提取的TDM-2抗体（热变量）TDM-2抗体，Alexa^<tm>抗鼠IgG（H+L）2。与下一种抗体反应后，用非尾二氧化硅毛细管分开。当通过488nm氩离子激光检测到二抗的荧光荧光时，似乎从DNA-TDM-2抗体秒抗体得出的峰被检测到，并且由于紫外线的量增加了面积。。在这个财政年度，只能使用使用抗体的初步实验，但是由于可以使用毛细管电动游泳方法检测到DNA损伤，因此将来将使用各种维修相关因素和抗体使用各种DNA将应用于损害的检测系统。