抗DNA損傷モノクロ-ナル抗体競合法を用いたヒトDNA損傷結合因子の解析

抗DNA损伤单克隆抗体竞争法分析人类DNA损伤结合因子

基本信息

批准号：
03152048
负责人：
松永司
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03152048/
关键词：
紫外線 DNA損傷 DNA修復ヒト細胞モノクロ-ナル抗体ゲルシフト法

项目摘要

当研究室では、これまで、紫外線誘発DNA損傷を特異的に認識するモノクロ-ナル抗体の樹立を行ない、チミン二量体(TDMー1,2,3)、(6ー4)光産物(64Mー1,2,3,4,5)、Dewar型光産物(DEMー1)の各損傷に対する9種のモノクロ-ナル抗体の樹立に成功した(Mori et al.,1988;Mizuno et al.,1991;Mori et al.,1991;Matsunaga et al.,投稿中)。本研究では、これらの抗体の損傷特異性を利用して、ヒトDNA修復機構における損傷認識ステップの解析を行なった。1)まず、DNA修復過程をより分子的に解析するために、Woodら(1988)により樹立された試験管内修復系を導入し、上記の抗体を併用することにより、修復合成に加えて損傷除去も追跡できる系を確立した。この系において、チミン二量体の除去に伴う修復合成のパッチサイズは、約20塩基程度であることが明らかとなった。2)抗DNA損傷モノクロ-ナル抗体と細胞内DNA損傷結合因子は、DNA損傷結合能という共通の性質を持つことから、以下の解析を行なった。a)抗DNA損傷抗体と紫外線照射DNAとの結合は、HeLa細胞の粗抽出液により濃度依存的に阻害された。b)試験管内修復系に、抗DNA損傷抗体を添加すると、修復反応が阻害された。c)ゲルシフト法において、抗DNA損傷抗体ならびに細胞粗抽出液とも、バンドのシフトが観察されたが、その移動度は異なっていた。以上の結果より、抗DNA損傷モノクロ-ナル抗体競合法は、細胞内DNA損傷結合因子の解析、ならびにその分離・精製に有用であることが示された。3)抗体のパラト-プに対する抗イディオタイプ抗体は、元の抗原と類似した構造をとることが知られており、抗DNA損傷モノクロ-ナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体を樹立するプロジェクトに着手した。現在、64Mー2抗体と紫外線照射DNAとの結合を阻害する抗体を産生するハイブリド-マ2種を得ており、クロ-ニングを行なっている。最終的に、アフィニテイ-クロマトグラフイ-法を駆使して、細胞内DNA損傷結合因子の分離を目指したい。

在我们的实验室中，我们开发了特异性识别紫外线诱导的 DNA 损伤的单克隆抗体和针对杜瓦光产物 (DEM-1) 每种损伤的九种单克隆抗体（Mori 等人，水野等人。等人，1991 年；Mori 等人，1991 年；Matsunaga 等人，提交中）。在本研究中，我们利用这些抗体的损伤特异性来分析人类DNA修复机制中的损伤识别步骤。 1）首先，为了更分子地分析DNA修复过程，我们引入了Wood等人建立的体外修复系统，我们还建立了一个允许跟踪的系统。在该系统中，发现与胸腺嘧啶二聚体去除相关的修复合成的补丁大小约为20个碱基。 2)由于抗DNA损伤单克隆抗体和细胞内DNA损伤结合因子具有DNA损伤结合能力的共同特性，因此进行以下分析。 a) HeLa细胞粗提物以浓度依赖性方式抑制抗DNA损伤抗体与紫外线照射的DNA的结合。 b) 当将抗DNA损伤抗体添加到体外修复系统中时，修复反应被抑制。 c) 在凝胶位移法中，抗DNA损伤抗体和粗细胞提取物均观察到条带位移，但迁移率不同。上述结果表明，抗DNA损伤单克隆抗体竞争法可用于细胞内DNA损伤结合因子的分析及其分离和纯化。 3）已知针对抗体互补位的抗独特型抗体具有与原始抗原相似的结构，因此我们启动了一个项目来建立针对抗DNA损伤的单克隆抗体的抗独特型抗体。目前，我们已经获得了两种杂交瘤，它们产生的抗体可抑制64M-2抗体与紫外线照射的DNA的结合，目前正在克隆它们。最终，我想使用亲和层析来分离细胞内 DNA 损伤结合因子。