除去修復エンドヌクレアーゼ機能とその欠損による原子病態の生化学的解析

切除修复核酸内切酶功能的生化分析及其缺陷引起的原子病理学

基本信息

批准号：
09269207
负责人：
松永司
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

XPGとXPE-ERCC1タンパクは、ヌクレオチド除去修復(NER)機構においてそれぞれ3′,5′切断酵素として働くが、本来はバブルやループなどの特殊なDNA構造を基質とするエンドヌクレアーゼである。これらの遺伝子(XPGあるいはERCC1)を欠損したマウスはいづれも成長阻害を示し、離乳前にすべて死亡する。本研究では、この両エンドヌクレアーゼのNER機構以外での機能に着目し、その本体を明らかにすることを目的とした。本年度の主な研究成果は以下のとおりである。1.バキュロウィルス/昆虫細胞系を用いてXPGタンパクを高発現させ、3種のカラムステップにより精製した。様々なDNA基質を用いて切断活性を調べたところ、1-3ntのバブル(塩基ミスマッチ)型DNA基質に対しても切断活性を示すことが明らかとなった。また、3ntのループ(IDミスマッチ)型DNA基質に対する切断活性も認められ、酵素活性的にはDNA中に生じたミスマッチ部分に対してXPGが働き得る可能性が示唆された。2.放医研の塩見らによって樹立されたxpgノックアウトマウス胎児由来細胞を継代培養したところ、最初は正常あるいはヘテロ細胞より増殖率が低かったものの、途中から急激に増殖率が上昇し、正常やヘテロ由来細胞よりも早く株化した。4継代ごとに細胞よりDNAを抽出して、マイクロサテライト解析を行ったところ、調べた8種類のプライマーのうち2種類で継代に伴ったバンドパターンの変化が観察された。3.酵母のTwo-hybridシステムを用いてXPGタンパクと相互作用する可能性のある4つのクローンを分離した。現在、塩基配列の決定、ならびに各相互作用についてのin vitroでの確認を行っている。4.MBP-XPG、あるいはMBP-ERCC1を抗原としてマウスに免疫を行い、これまでにXPGタンパクに対するモノクローナル抗体を4種類樹立した。

XPG 和 XPE-ERCC1 蛋白在核苷酸切除修复 (NER) 机制中分别充当 3' 和 5' 切割酶，但它们最初是使用特殊 DNA 结构（如气泡和环）作为底物的核酸内切酶。缺乏这些基因（XPG 或 ERCC1）的小鼠表现出生长迟缓，并且在断奶前全部死亡。在本研究中，我们重点关注这些核酸内切酶的 NER 机制以外的功能，旨在阐明它们的真实本质。今年的主要研究成果如下。 1. 使用杆状病毒/昆虫细胞系统高度表达 XPG 蛋白，并使用三层柱步骤纯化。当使用各种DNA底物研究切割活性时，发现对于1-3nt气泡(碱基错配)型DNA底物也显示切割活性。此外，还观察到针对3nt环（ID错配）型DNA底物的切割活性，这表明XPG可能在酶活性方面作用于DNA中产生的错配部分。 2. Shiomi等人在国立放射线科学研究所建立的xpg敲除小鼠胎儿细胞进行传代培养时，增殖率最初低于正常或杂合细胞，但中途增殖率迅速增加，导致在正常或杂合细胞中，它比衍生细胞更早建立到细胞系中。当每四次传代从细胞中提取 DNA 并进行微卫星分析时，观察到所检查的八种引物中的两种带模式随传代的变化。 3.利用酵母二杂交系统，分离出4个可能与XPG蛋白相互作用的克隆。目前，我们正在确定每种相互作用的碱基序列和体外确认。 4.以MBP-XPG或MBP-ERCC1为抗原免疫小鼠，目前已建立了四种针对XPG蛋白的单克隆抗体。