除去修復エンドヌクレアーゼ機能とその欠損による原子病態の生化学的解析

切除修复核酸内切酶功能的生化分析及其缺陷引起的原子病理学

基本信息

批准号：
09269207
负责人：
松永司
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

XPGとXPE-ERCC1タンパクは、ヌクレオチド除去修復(NER)機構においてそれぞれ3′,5′切断酵素として働くが、本来はバブルやループなどの特殊なDNA構造を基質とするエンドヌクレアーゼである。これらの遺伝子(XPGあるいはERCC1)を欠損したマウスはいづれも成長阻害を示し、離乳前にすべて死亡する。本研究では、この両エンドヌクレアーゼのNER機構以外での機能に着目し、その本体を明らかにすることを目的とした。本年度の主な研究成果は以下のとおりである。1.バキュロウィルス/昆虫細胞系を用いてXPGタンパクを高発現させ、3種のカラムステップにより精製した。様々なDNA基質を用いて切断活性を調べたところ、1-3ntのバブル(塩基ミスマッチ)型DNA基質に対しても切断活性を示すことが明らかとなった。また、3ntのループ(IDミスマッチ)型DNA基質に対する切断活性も認められ、酵素活性的にはDNA中に生じたミスマッチ部分に対してXPGが働き得る可能性が示唆された。2.放医研の塩見らによって樹立されたxpgノックアウトマウス胎児由来細胞を継代培養したところ、最初は正常あるいはヘテロ細胞より増殖率が低かったものの、途中から急激に増殖率が上昇し、正常やヘテロ由来細胞よりも早く株化した。4継代ごとに細胞よりDNAを抽出して、マイクロサテライト解析を行ったところ、調べた8種類のプライマーのうち2種類で継代に伴ったバンドパターンの変化が観察された。3.酵母のTwo-hybridシステムを用いてXPGタンパクと相互作用する可能性のある4つのクローンを分離した。現在、塩基配列の決定、ならびに各相互作用についてのin vitroでの確認を行っている。4.MBP-XPG、あるいはMBP-ERCC1を抗原としてマウスに免疫を行い、これまでにXPGタンパクに対するモノクローナル抗体を4種類樹立した。

XPG和XPE-ERCC1蛋白分别充当核苷酸切除修复（NER）机制中的3'，5'切割酶，是最初是特殊DNA结构（例如气泡和环）的底物的核酸内切酶。所有缺乏这些基因的小鼠（XPG或ERCC1）均表现出生长抑制作用，并且在断奶前死亡。这项研究的重点是除NER机制以外的两种核酸内切酶的功能，并旨在澄清其主体。今年的主要研究结果如下。 1。使用杆状病毒/昆虫细胞系高表达XPG蛋白，并使用三个列步骤纯化。当使用各种DNA底物检查裂解活性时，据显示，它还针对1-3nt气泡（基本不匹配）DNA底物表现出裂解活性。此外，还观察到针对3NT循环（ID不匹配）DNA底物的切割活性，这表明XPG可以作用于酶活性中DNA中发生的不匹配部分。 2。当Shiomi等人建立的XPG基因敲除小鼠的胎儿衍生出细胞时。在国家放射学研究所，亚培养研究所最初低于正常或杂细胞细胞的生长速率，但生长速率突然增加了一半，并且应变变成比正常或杂细胞细胞更快的应变。从每四个段落中提取细胞中提取DNA，并进行了微卫星分析，所检查的八个引物中有两个显示与通道相关的带模式的变化。 3。使用酵母双杂交系统分离可以与XPG蛋白相互作用的四个克隆。当前，确定核苷酸序列并在体外确认每种相互作用。 4。使用MBP-XPG或MBP-ERCC1作为抗原对小鼠进行免疫，到目前为止，建立了针对XPG蛋白的四种单克隆抗体。