真核細胞のDNA複製に関与するDNAヘリカーゼの探索

寻找参与真核细胞 DNA 复制的 DNA 解旋酶

基本信息

批准号：
06772176
负责人：
浴俊彦
金额：
$ 0.77万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06772176/
关键词：
DNA複製 DNAヘリカーゼ DNAプライマーゼ DNAポリメラーゼalpha cDNA

项目摘要

(1)DNAポリメラーゼalpha固相化カラムによる複製に関与するDNAヘリカーゼの同定について:ヒトDNAポリメラーゼと強固な複合体を形成し、DNA複製開始に必要なDNAプライマーゼと物理的に相互作用するヘリカーゼの検出を目指している。まずヒトDNAプライマーゼをコードする46,56kDa両サブユニットcDNAをヒトKB細胞cDNAライブラリーより単離・構造解析を行った。さらに固相化カラムの調製に必要な両蛋白質の過剰発現を目的として、大腸菌を宿主とする組み換えDNAの蛋白質発現を試みたが上手くいかなかった。現在、バキュロウイルス系による蛋白質発現を試みている。(2)DNAヘリカーゼファミリーの単離の試みについて:ヘリカーゼモチーフを持つ遺伝子(cDNA)の単離をめざして、2通りのPCRプライマー(モチーフIa<‐‐>II<‐‐>V)を設計して低いアニール温度(37度)にてcDNAライブラリーを鋳型にPCRを行った結果、1つのプライマー(II【tautomer】V)で約550bp付近に単一のバンドが検出できた。このバンドを単離してプロープとし、ヒトKB細胞cDNAライブラリーを現在スクリーニングしている。またPCRを用いるためにcDNA中の存在比に影響されるため、均衡化されたライブラリーの使用を検討している。(3)生化学的に同定されたヘリカーゼについてそれらの一次構造(モチーフ)情報を得るため、東大・薬学部(榎本助教授)と共同研究を行い、ヒトDNAヘリカーゼQ1についてはその染色体座位(12p12)を決定し、またヘリカーゼBについてマウスcDNAクローンの単離とその一次構造解析を行っている。

（1）鉴定通过DNA聚合酶α固定柱与复制相关的DNA解旋酶：我们的目的是检测与人DNA聚合酶形成健壮复合物的旋转酶，并与DNA复制起始所需的DNA Primass物理相互作用。首先，分离了编码人DNA原始酶的46,56 kDa亚基cDNA，并从结构上从人类KB细胞cDNA文库进行结构分析。此外，为了过表达固定柱制备所需的两种蛋白质，我们试图表达重组DNA的蛋白质，该蛋白与大肠杆菌作为宿主重组，但它不起作用。目前，我们正在尝试通过杆状病毒系统表达蛋白质。 (2) An attempt to isolate the DNA helicase family: With the aim of isolating genes (cDNAs) with helicase motifs, two PCR primers (motif Ia<‐‐>II<‐‐>V) were designed and PCR was performed using a cDNA library at a low annealing temperature (37 degrees), and a single band was detected at about 550 bp with one primer (II[tatomer]V).该频带被隔离和探测，目前正在筛选人类KB细胞cDNA文库。我们还在考虑使用平衡的库，因为它们受cDNA中丰度比的影响。（3）为了获得有关生物化学鉴定的原始酶的主要结构（基序）的信息，我们与东京大学（助理教授Inomoto）的药学学院进行了联合研究，并决定了染色体基因座（12p12）对人DNA Helicase Q1的染色体基因座（12p12），我们还针对人类hulicase Q1和我们的主要结构进行了隔离式二元组cdna clones anstals cdna clones。