DNA複製に関与するヒトDna2ヘリカーゼの構造と機能解析

参与 DNA 复制的人 Dna2 解旋酶的结构和功能分析

• 批准号: 08772128
• 负责人: 浴 俊彦
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08772128/
• 关键词: DNA複製; ヘリカーゼ; ヒトホモログ; 出芽酵母; 遺伝子破壊; 染色体マッピング

ヒトDNA複製に関与するヘリカーゼの候補である、ヒトDna2ヘリカーゼの機能解析を行うために以下の実験を行った。1.Dna2ヘリカーゼをコードするcDNAを単離した。ノーザン解析で検出されるバンドザイズに近い4.2kbの塩基配列を決定したが、5'末端のメチオニン残基が検出されないことから完全長ではなかった。5'RACE法によるクローニングを試みたが、5'末端部の回収はできていない。2.クローン化したcDNA(3'UTRを一部除く約3.5kb)をバキュロウイルスベクター(pFastBAC)に組み込んだ発現コンストラクトを作製した。現在、その蛋白質発現について検討中である。3.ヒト遺伝病との関連を検討するためにDna2ヘリカーゼ遺伝子の染色体マッピングを行い、ハイブリッドパネル法とFISH法との併用により第10染色体バンドq21.3-q22.1にマップした。このローカス(DNA2L)近傍は、del(10)(q22-q24)やinv(10)(q11-q21)などの癌関連染色体異常が報告されている。4.出芽酵母Dna2ヘリカーゼの機能相補性実験のためのDna2遺伝子破壊株を作製した。遺伝子破壊は、HIS3遺伝子挿入により行ない、破壊株は4分子解析で致死であることが確認された。

进行以下实验来分析人类Dna2解旋酶的功能，该解旋酶是参与人类DNA复制的候选解旋酶。 1.分离编码Dna2解旋酶的cDNA。确定了4.2 kb的碱基序列，该序列接近Northern分析检测到的条带大小，但它不是全长，因为没有检测到5'端的蛋氨酸残基。尝试使用5'RACE方法进行克隆，但无法恢复5'端。 2.通过将克隆的cDNA（大约3.5kb，不包括部分3'UTR）掺入杆状病毒载体（pFastBAC）中来创建表达构建体。我们目前正在研究蛋白质的表达。 3.对Dna2解旋酶基因进行染色体定位，探讨其与人类遗传疾病的关系，利用混合panel法和FISH方法将该基因定位到10号染色体带q21.3-q22.1。据报道，该基因座 (DNA2L) 附近存在与癌症相关的染色体异常，例如 del(10)(q22-q24) 和 inv(10)(q11-q21)。 4. 我们创建了 Dna2 基因破坏菌株，用于酿酒酵母 Dna2 解旋酶的功能互补实验。通过插入HIS3基因进行基因破坏，通过四分子分析确认破坏菌株具有致死性。

项目成果

Toshihiko Eki: "Mapping of the human homologue (ORCIL) of the yeast origin recognition complex subunit l gene to chromosome band lp32" Genomics. 36(3). 559-561 (1996)

Toshihiko Eki：“酵母起源识别复合体 l 亚基基因的人类同源物 (ORCIL) 到染色体带 lp32 的映射”基因组学。

Yohei Miyagi: "Assignment of the human PP5/TFPI-2 gene to 7q22 by FISH and PCR-based human/rodent cell hybrid mapping panel analysis" Genomics. 35(1). 267-268 (1996)

Yohei Miyagi：“通过 FISH 和基于 PCR 的人类/啮齿动物细胞杂交图谱分析将人类 PP5/TFPI-2 基因分配给 7q22”Genomics。

Toshihiko Eki: "A long-range physical map of human chromosome 21q22.1 band from the YAC continuum" Mammalian Genome. 7(2). 303-311 (1996)

Toshihiko Eki：“来自 YAC 连续体的人类染色体 21q22.1 带的远程物理图谱”哺乳动物基因组。

Toshihiko Eki: "Cloning and characterization of novel gene,DCRR1,expressed from Down's syndrome critical region of human chromosome 21q22.2" DNA Sequence. (in press).

Toshihiko Eki：“从人类染色体 21q22.2 唐氏综合症关键区域表达的新基因 DCRR1 的克隆和表征”DNA 序列。

Toshihiko Eki: "Assignment of the closest human homologue (DNA2L;KIAA0083) of the yeast Dna2 helicase gene to chromosome band 10q21.3-q22.1" Genomics. 37(3). 408-410 (1996)

Toshihiko Eki：“将酵母 Dna2 解旋酶基因最接近的人类同源物 (DNA2L;KIAA0083) 分配给染色体带 10q21.3-q22.1”基因组学。