ヒト細胞のDNA代謝に関与するヘリカーゼの探索と構造解析

参与人体细胞DNA代谢的解旋酶的搜索和结构分析

基本信息

批准号：
07772205
负责人：
浴俊彦
金额：
$ 0.7万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772205/
关键词：
ヘリカーゼファミリー DNA代謝 RNA代謝ホモロジーサーチ酵母 cDNA ホモログ

项目摘要

(1)系統的なヒトヘリカーゼファミリー遺伝子を単離するために、ヘリカーゼファミリーに共通したモチーフ配列(DEAD等 motif I-VI)に対するPCR primerをデザインして、HeLa細胞より作製されたcDNAライブラリーからPCRによって候補遺伝子断片を増幅・回収することを試みた。単離されたcDNA断片をクローンし、一部につき塩基配列解析を行った。しかし、ライブラリー中のcDNA種の偏りを反映し、elongation factorなどabundantなcDNAクローン断片が数多く得られ、稀少なcDNA種を見出すことは困難であった。(2)そこでヘリカーゼファミリーの単離について、(1)とは別のアプローチを取ることに決めた。即ち、現在、その全塩基配列が決定されつつある酵母遺伝子からヘリカーゼファミリーに保存されたモチーフを持った遺伝子を同定し、これらの遺伝子の遺伝子破壊、蛋白質発現によるヘリカーゼ活性の検討、および相同性検索によるヒトホモログの同定を通じて、新たなヘリカーゼファミリー遺伝子を単離することを試みている。既に酵母で変異株などとして同定されたものを除く新規遺伝子8個を選び、遺伝子破壊を行った結果、少なくとも5個の増殖に必須なヘリカーゼファミリー遺伝子を見出している。現在、その生理的機能・酵素活性などについて検討している。(3)生化学的に同定されたヘリカーゼについてそれらの一次構造(モチーフ)情報を得るため、東大・薬学部(榎本助教授)と共同で、マウスDNAヘリカーゼBについてその一次構造解析を行った。しかし、ヒトDNAヘリカーゼBについては複数のcDNAライブラリーやRT-PCRなどによるスクリーニングでは単離することができなかった。

(1)为了分离系统性的人类解旋酶家族基因，我们设计了解旋酶家族共有的基序序列(基序I-VI，例如DEAD)的PCR引物，并从HeLa细胞制备的cDNA文库中使用它们。通过PCR扩增并回收候选基因片段。克隆分离的cDNA片段并对其中的一部分进行核苷酸序列分析。然而，反映了文库中cDNA种类的偏差，获得了许多丰富的cDNA克隆片段，例如延伸因子，使得很难找到稀有的cDNA种类。 (2) 因此，我们决定采取不同的方法来分离(1)中的解旋酶家族。也就是说，我们将从目前正在确定完整核苷酸序列的酵母基因中鉴定具有解旋酶家族保守基序的基因，对这些基因进行基因破坏，通过蛋白质表达检查解旋酶活性，并进行同源性搜索。通过鉴定人类同源物发现新的解旋酶家族基因。在选择八个新基因（排除那些已被鉴定为酵母突变菌株的基因）并进行基因破坏后，他们发现了至少五个对于增殖至关重要的解旋酶家族基因。我们目前正在研究其生理功能和酶活性。 (3) 为了获得生化鉴定的解旋酶的一级结构（基序）信息，我们与东京大学药学部（榎本助理教授）合作，对小鼠 DNA 解旋酶 B 进行了一级结构分析。然而，通过使用多个cDNA文库筛选或RT-PCR无法分离人DNA解旋酶B。