染色体複製起点へのヘリカーゼ導入機構：開始複合体の機能構造とその分子動態の解明

解旋酶引入染色体复制起点的机制：阐明起始复合物的功能结构及其分子动力学

• 批准号: 22KJ2423
• 负责人: 吉田 竜星
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2423/
• 关键词: DnaA; 染色体DNA複製; 複合体動態; ヘリカーゼ装着; DnaA; 染色体DNA複製; 複合体動態; ヘリカーゼ装着

染色体DNA複製は染色体上の複製起点領域から両方向に開始される。この基本的な原理がどのような分子機構によって支えられているのかは未だ解明されていない。その原因としては開始因子DnaAを主とする複製開始複合体が高次で動的な動態をもつため分子メカニズムの解析が困難であったことが大きい。しかしながら大腸菌では近年、染色体複製起点領域に形成される複製開始複合体の高次構造解明が大きく進歩したことで、複製開始複合体が機能の異なる左側と右側の二つのサブ複合体から構成されることが明らかになった。また、左側複合体が複製起点の二重鎖DNAを一本鎖化する分子機構までが解明された。本研究では、この新たな進展を大いに活用して、複製開始複合体が一本鎖化したDNA部位へと複製ヘリカーゼを両方向に装着するまでの分子動態を解析する。2年計画の初年度である2022年度においては、まず左側・右側DnaAサブ複合体のそれぞれと複製ヘリカーゼとの相互作用を解析するため多様な変異oriCプラスミドなどを構築した。これらを多様な変異DnaAタンパク質や複製ヘリカーゼタンパク質と試験管内で組み合わせ、DnaAのプロトマーレベルで生化学的に複製ヘリカーゼ装着活性を解析した。また、これらの結果は染色体oriCに同様の変異をもつ大腸菌変異株を用いた遺伝学的解析によっても検証した。さらに、左側・右側DnaAサブ複合体が互いに相互作用するかについても生化学的に検証した。

染色体DNA复制始于染色体上复制区域的两个方向。目前尚不清楚该基本原理的基础是哪些分子机制。这在很大程度上是由于复制起始复合物（主要是启动因子DNAA）具有较高和动态动力学的事实，因此很难分析分子机制。然而，在大肠杆菌中，近年来在阐明复制起源复制络合物的高阶结构方面取得了重大进展，揭示了复制启动络合物由两个左侧和右侧的两个亚复合物组成，具有不同的功能。此外，已经阐明了左复合单链双链DNA的分子机制，即复制的起源。这项研究极大地利用了这一新开发物来分析复制起始复合物的分子动力学，直到复制解旋酶在两个方向上连接到单链DNA位点。在2022年，两年计划的第一年，首先构建了各种突变的Oric质粒，以分析左右DNAA亚复合体和复制解旋酶之间的相互作用。这些在体外与多种突变的DNAA蛋白和复制性解旋酶蛋白结合在一起，以分析DNAA原型水平的生化复制性解旋酶的附着活性。还使用大肠杆菌突变菌株在染色体染色体中使用大肠杆菌突变菌株通过遗传分析来验证这些结果。此外，我们还生化测试了左右DNAA子复合物是否相互作用。