真核細胞DNAプライマーゼ複合体の構造と機能に関する分子遺伝学的研究

真核生物DNA引物酶复合物结构和功能的分子遗传学研究

基本信息

批准号：
05772008
负责人：
浴俊彦
金额：
$ 0.7万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05772008/
关键词：
DNAプライマーゼ cDNA 複製関連酵素染色体マッピング

项目摘要

DNAプライマーゼは、原核細胞から真核細胞にいたるまでDNA複合開始に必須な酵素である。本研究においては、ヒトDNAプライマーゼを構成する46kDa、54kDaサブユニットをコードするcDNAクローンの一次構造の解析、ゲノミック遺伝子の解析を通じて、DNAプライマーゼに関する分子生物学的知見を得ることを目的とした。その結果、以下のことが明らかにされた。1 ヒトDNAプライマーゼを構成する46kDa、54kDaサブユニットをコードするcDNAクローンをlambdagt10ライブラリーより単離し、全一次構造を決定した。46kDaサブユニットについては420アミノ酸残基の、また54kDaサブユニットについては505アミノ酸残基から成るopen reading frameを得た。2 一次構造について酵母、マウス、ヒトで比較した結果、両サブユニットについて5カ所づつの保存されたドメイン(金属結合モチーフ等を含む)が見いだされた。また糖鎖付加部位については46kDa、54kDaサブユニットにつき2カ所、1カ所の存在が示唆された。3 ノーザン法により46kDaサブユニットについては2.7kbと1.4kbの、また54kDaサブユニットについては2.4kbの長さの転写産物が検出された。4 ESTプライマーと雑種細胞DNAパネルとを用いたPCR解析、また各々の遺伝子を含むコスミドクローンを用いた蛍光in situ hybridization法によって遺伝子の染色体マッピングを行った結果、46kDaサブユニット遺伝子については1番染色体テロメアに、54kDaサブユニット遺伝子については、3番と6番(短腕セントロメア近傍)染色体に座乗していることが明らかにされた。5 発現ベクターを利用した両蛋白質の大量調製、また各遺伝子につき5'上流領域を含むエキソン・イントロン構造の解析を現在行っている。

DNA引物酶是原核和真核细胞中DNA复合物起始的必需酶。在本研究中，我们旨在通过分析编码构成人类DNA引物酶的46kDa和54kDa亚基的cDNA克隆的一级结构以及分析基因组基因来获得有关DNA引物酶的分子生物学知识。结果，澄清了以下内容。 1.从lambdagt10文库中分离出编码构成人DNA引物酶的46kDa和54kDa亚基的cDNA克隆，并测定了完整的一级结构。获得了由46kDa亚基的420个氨基酸残基和54kDa亚基的505个氨基酸残基组成的开放阅读框。 2 酵母、小鼠和人类一级结构的比较表明，每个亚基都有五个保守结构域（包括金属结合基序等）。关于糖基化位点，有人认为46kDa和54kDa亚基有2个位点和1个位点。 3 通过 Northern 方法，检测到 46kDa 亚基长度为 2.7kb 和 1.4kb 的转录本，54kDa 亚基长度为 2.4kb 的转录本。 4 使用 EST 引物和杂交细胞 DNA panel 进行 PCR 分析，并使用含有各基因的粘粒克隆通过荧光原位杂交对基因进行染色体作图，结果发现 46kDa 亚基基因位于 1 号染色体上。研究表明，端粒的54kDa亚基基因位于3号和6号染色体上（靠近短臂着丝粒）。 5 我们目前正在使用表达载体制备大量这两种蛋白质，并正在分析每个基因的外显子和内含子结构，包括 5' 上游区域。