新規RNAヘリカーゼD1の研究を通じた高等真核生物のゲノム安定性維持機構の解明

通过新型RNA解旋酶D1的研究阐明高等真核生物基因组稳定性维持机制

基本信息

批准号：
17590057
负责人：
浴俊彦
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者が実施した線虫ヘリカーゼファミリーの網羅的な機能解析において、RNAi処理個体がX線感受性を示す新規RNAヘリカーゼ遺伝子として初めて同定されたD1(D2005.5, drh-3)遺伝子について、その生理機能を明らかにするための研究を行い、以下に示す成果を得た。(1)D1遺伝子の機能抑制が及ぼす影響について詳細な検討を行った結果、生殖細胞形成過程で染色体分離に異常が生じ、受精卵の胚性致死が誘起されることを初めて明らかにした。またD1遺伝子機能抑制により、X線照射やカンプトテシンに対して高感受性が観察されたが、卵巣の細胞分裂能、寿命、および複製・DNA損傷チェックポイント応答には異常は認められなかった。(2)大腸菌およびバキュロウイルスによる発現系を用いた組換えD1タンパク質の調製を試みた。大腸菌発現系では大量の目的タンパク質は不溶化して活性型のタンパク質として回収は困難であった。バキュロウイルス発現系では発現量は少ないが可溶化タンパク質として回収できる結果を得ており、現在調製を進めている。(3)酵母two-hybrid解析による相互作用タンパク質のスクリーニングを行った結果、約13個の候補遺伝子が同定された。D1タンパク質が機能する可能性のあるDNA修復やRNAi関連タンパク質(合計12種類)との相互作用は確認されなかった。(4)哺乳類のD1ホモログは未だ明確でないが、最類縁のタンパク質は抗ウイルス応答に関与することが示唆された。研究期間中(2006年)にMelloらはプロテオーム解析によって、D1(D2005.5, DRH-3)がRNAiに関与することを示唆した。当該報告と本研究結果から、D1(DRH-3)タンパク質は生殖細胞形成過程で染色体分離に必要なRNAi因子であることが初めて明らかになり、現在、RNAiによる染色体動態制御機構に焦点を絞って研究を展開中である。

在申请人对秀丽隐杆线虫解旋酶家族进行的全面功能分析中，我们研究了D1（D2005.5，drh-3）基因的生理学，该基因首次被鉴定为新型RNA解旋酶基因，显示X我们进行了研究以阐明其功能，并获得了如下所示的结果。 (1)通过对抑制D1基因功能的影响进行详细研究，我们首次揭示了生殖细胞形成过程中发生异常染色体分离，导致受精卵胚胎致死。此外，由于D1基因功能的抑制，观察到对X射线照射和喜树碱的高敏感性，但在卵巢细胞分裂能力、寿命或复制/DNA损伤检查点反应方面未观察到异常。 (2)我们尝试利用大肠杆菌和杆状病毒表达系统制备重组D1蛋白。在大肠杆菌表达系统中，大量目的蛋白不溶，很难回收活性蛋白。使用杆状病毒表达系统，虽然表达量较低，但已获得可将蛋白质作为可溶化蛋白质回收的结果，目前正在进行制备。 (3)通过酵母二杂交分析筛选相互作用蛋白，结果鉴定出约13个候选基因。未证实与 D1 蛋白可能发挥作用的 DNA 修复或 RNAi 相关蛋白（总共 12 种）有相互作用。 (4) 尽管哺乳动物D1同源物仍不清楚，但最密切相关的蛋白质被认为参与抗病毒反应。在研究期间（2006年），Mello等人通过蛋白质组分析提出D1（D2005.5，DRH-3）参与RNAi。从这份报告和本研究结果中，首次揭示了D1（DRH-3）蛋白是生殖细胞形成过程中染色体分离所需的RNAi因子，目前我们正在关注其机制。目前正在进行通过 RNAi 控制染色体动态的研究。