哺乳類細胞のDNA複製に関与するDNAヘリカーゼの同定と機能の解析

哺乳动物细胞中参与 DNA 复制的 DNA 解旋酶的鉴定和功能分析

基本信息

批准号：
06780497
负责人：
多田周右
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780497/
关键词：
DNA複製 DNAヘリカーゼ温度感受性変異株 DNAプライマーゼ

项目摘要

DNAヘリカーゼBが温度感受性になっていると思われるマウスFM3A細胞の変異株、tsFT848株より4種のカラムクロマトグラフィーを用いてDNAヘリカーゼBの部分精製を行った。同様にして精製した野性株由来のDNAヘリカーゼBとの温度感受性を比較したところ、tsFT848細胞由来のDNAヘリカーゼBのDNA依存性ATP分解活性は部分精製された状態であっても非許容温度したでの不安定性が野性株に比べ高まっていた。さらに、部分精製をおこなったことによりヘリカーゼ活性の比較が可能になったが、この結果においてもtsFT848細胞由来のDNAヘリカーゼBの非許容温度下での不安定性が示された。以上の結果より、tsFT848細胞が非許容温度下でDNA合成を停止する原因はDNAヘリカーゼBの温度感受性変異によることが更に強く示唆された。また、tsFT848細胞より部分精製したDNAヘリカーゼBの非許容温度下での失活は一本鎖DNAの共存により防ぐことができるため、細胞内においてもDNAに結合していない状態のDNAヘリカーゼBの失活が温度感受性のDNA合成の低下の原因となっていると考えられる。tsFT848細胞を用いておこなったfiber-autoradiographyにおいても伸長を開始したDNA上での新生DNAの長さには野性株との間に有意な差は見られず、高温による失活の標的はDNAに結合していない状態にあるDNAヘリカーゼBであることを示している。さらにFM3A細胞より精製したDNAヘリカーゼBとDNAプライマーゼの相互作用を調べる目的で、DNAヘリカーゼB共存下でのDNAプライマーゼ活性を測定した。DNAプライマーゼ活性はDNAプライマーゼによって一本鎖M13DNA上に合成されるプライマーRNAを電気泳動により分離する方法を用いて解析した。この結果、DNAプライマーゼによって合成される10ヌクレオチド前後のオリゴリボヌクレオチドがDNAヘリカーゼの共存により著しく増加することが観察された。これはDNAヘリカーゼBがDNA複製に関わっていることをさらに支持する結果である。

使用来自小鼠FM3A细胞的突变株的四列色谱进行DNA解旋酶B的部分纯化，被认为对DNA旋转酶B敏感。非验证温度高于野生应变的温度。此外，部分纯化允许比较解旋酶活性，并且该结果还显示了在非耐药温度下衍生自TSFT848细胞的DNA解旋酶B的不稳定性。上述结果进一步强烈表明，在非腐蚀温度下阻止DNA合成的TSFT848细胞的原因是由于DNA旋转酶B中的温度敏感突变引起的。此外，DNA解旋酶B灭活DNA解旋酶B部分从TSFT848细胞中部分纯化了TSFT848细胞在非疗效的情况下，并且可以预防单一的促进，并在单一的促进中估计，并在单一的促进中估计了Singna，并且是由单一的促进的估计，并且是由单一的co na估计，并且是由单一的co na估计，并且是由单一的促进性促进的。 DNA解旋酶B与细胞中的DNA无关，是导致温度敏感DNA合成的降低。在使用TSFT848细胞进行的纤维上运动摄影中，在DNA上的新生DNA长度上没有明显差异，该DNA的长度开始随野生应变而开始伸长，这表明由于高温而导致的灭活靶标是DNA旋转酶B，这与DNA无关。此外，为了研究从FM3A细胞纯化的DNA解旋酶B与DNA起初酶之间的相互作用，在存在DNA解旋酶的存在下测量了DNA Primase活性。DNAPrimase B.使用一种分离由DNA Prirase合成的引物RNA的方法分析了DNA Primase活性。结果，观察到，由于DNA解旋酶的共存，由DNA引物合成的寡核苷酸肽显着增加。这进一步支持DNA解旋酶B参与DNA复制。