DNA二本鎖切断による発がん機構に関する無細胞実験系による解析

利用无细胞实验系统分析DNA双链断裂引起的致癌机制

基本信息

批准号：
14026006
负责人：
多田周右
金额：
$ 2.94万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14026006/
关键词：
がん DNA二本鎖切断 DNA修復 DNA複製タンパク質A Rad51 細胞周期チェックポイント

项目摘要

DNA二本鎖切断(DSB)は、放射線やある種の薬物に対する被爆、あるいは比較的軽度のDNA障害を残したままDNA複製が進行することなどにより生じ得る。このようなDSBは、染色体構造の異常などを伴うより重篤な遺伝子構造・遺伝情報の破壊を誘起する可能性を持っており、様々な環境要因ががんや遺伝的障害の起因となる場合にDSBを介することは少なくないと考えられる。現に多くの発がん誘発性遺伝的疾患の原因遺伝子についてDSB認識・修復との関連が示唆されるに至っている。本研究では、このDSBに対する認識応答・修復反応を無細胞的に再現し、その分子的機序を生化学的に解析することを試みている。このために、Xenopus卵抽出液を用いた実験系を利用し、DSBを誘起するDNA傷害剤としてDNAトポイソメラーゼI阻害剤であるカンプトテシンおよび制限酵素EcoRIを使用した。クロマチン画分のwestern blottingによりヒストンH2AのひとつH2AXのリン酸化と共に、Mre11、RPA、Rad51等のDSB認識修復応答に関わる因子のクロマチン画分への蓄積が確認された。間接蛍光抗体法による顕微鏡観察により、これらの因子の蓄積はクロマチン上のDSB部位への結合を反映しているものであることが示唆された。さらに、RPA、Rad51蓄積部位においてDSBの修復に伴うものと思われるDNA合成が検出された。このDNA合成はaphidicolinを添加することにより抑止されたが、細胞周期チェックポイント経路の阻害の影響は受けなかった。DSBに応じて細胞周期チェックポイント経路が活性化し卵抽出液中のDNA複製を抑止することも確認された。今後、この実験系を基本として遺伝子構造安定性維持機構の分子機序について明らかにしていきたいと考えている。

DNA双重链切割（DSB）可能是由辐射，某些药物的轰炸或具有相对温和的DNA疾病的DNA重复引起的。这种DSB具有诱导更严重的遗传结构和具有异常染色体结构的遗传信息的潜力，各种环境因素会导致癌症和遗传疾病。实际上，通过DSB识别和恢复，已经提出了许多致癌遗传疾病的原因。在这项研究中，我们正在尝试重现该DSB在Cellly中的感知和修复反应，并分析分子机制。因此，我们使用了使用爪蟾卵萃取的实验系统，并使用了DNA Toisomerase I抑制剂和受限的ECORI作为诱导DSB的DNA损伤剂。染色质绘画的蛋白质印迹证实了与DSB识别恢复响应有关的染色质绘画中因子的积累，例如MRE11，RPA，RAD51，以及H2AX H2AX磷酸化之一。通过间接抗体方法观察显微镜观察表明，这些因素的积累反映了与染色质上DSB位点的结合。此外，发现DNA合成似乎伴随着RPA和RAD51存储位点的DSB恢复。该DNA合成通过添加蚜虫蛋白恶化，但不受细胞周期检查点途径的抑制影响。还可以证实，根据DSB激活了细胞周期检查点途径，并且在卵中提取中的DNA复制是威慑力的。将来，我们想阐明基因结构的分子机制稳定维护机制，基于该实验系统。