染色体安定性維持に機能するヒストンアセチル化酵素Tip60複合体の生化学的解析

对维持染色体稳定性的组蛋白乙酰化酶 Tip60 复合物进行生化分析

基本信息

批准号：
16021204
负责人：
多田周右
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Tip60ヒストンアセチル化酵素複合体のゲノム安定性維持機構への寄与について解明するにあたり、DNA代謝との関連について機能的に理解しやすいと考えられた複合体構成タンパク質、Tap54αに照準を絞り、Xenopus卵抽出液無細胞実験系を用いて検討をおこなった。Tap54αの機能を欠損させるために、Walker Aモチーフ中のリジン残基をアルギニン残基に変えた組み換えタンパク質(Tap54α-K76R、以下K76Rと記す)を大腸菌において発現させ精製した。このK76Rを卵抽出液に添加し、再現されるDNA複製などの過程に及ぼす影響について検討をおこなった。その結果、DNA複製活性の顕著な低下が観察された。さらに詳細に解析するために、ウエスタンブロット法を用いてDNA複製に関与する種々のタンパク質のクロマチンへの結合について時間を追って観察した。その結果、K76Rの添加によりDNA複製ライセンス化反応に必須なタンパク質複合体であるMCM複合体のクロマチンへの結合量が顕著に減少していた。この時、DNA複製ライセンス化反応に関与するMCM複合体以外のタンパク質、Orc1、Cdc6、Cdt1のクロマチンへの結合については顕著な影響は見られなかった。すなわち、Tap54αがMCM複合体のクロマチンへの結合において重要な役割を果たしている可能性が示唆された。次にK76R添加によるDNA複製への影響についてDNA複製ライセンス化反応以後に的を絞って観察した。その結果、DNA複製活性が通常時の50%程度に減少することが分かった。すなわち、Tap54αがDNA複製開始反応あるいは伸長反応などのDNA複製過程においても何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。一方、野生型Tap54αを用いて同様の実験をおこなったところ、タンパク質の添加による影響は観察されなかった。

在阐明TIP60组蛋白乙酰酶复合物对维持基因组稳定性的贡献时，我们专注于Tap54α，Tap54α是一种复杂的组成蛋白，被认为在功能上易于理解，并使用无细胞的Xenopus Egg提取物进行了研究。为了缺乏TAP54α的功能，重组蛋白（TAP54α-K76R，以下称为K76R）在该功能中将赖赛（Walker）中的赖氨酸残基转换为精氨酸残基（TAP54α-K76R），并在大肠杆菌中表达并净化。将此K76R添加到鸡蛋提取物中，并研究了繁殖DNA复制的效果。结果，观察到DNA复制活性的显着降低。为了进行进一步的详细分析，使用蛋白质印迹观察到参与DNA复制与染色质的各种蛋白质的时间连接。结果，添加K76R可显着减少MCM复合物的结合量，MCM复合物是DNA复制许可反应必不可少的蛋白质复合物。目前，除了参与DNA复制许可反应，ORC1，CDC6和CDT1与染色质的MCM复合物以外的蛋白质的结合，尚无明显影响。也就是说，提示TAP54α可能在MCM复合物与染色质的结合中起重要作用。接下来，在DNA复制许可反应后，有目标观察到K76R对DNA复制的影响。结果，发现DNA复制活性降至正常水平的约50％。换句话说，建议TAP54α也可能在DNA复制过程中起作用，例如DNA复制起始或扩展反应。另一方面，当使用野生型TAP54α进行类似的实验时，未观察到添加蛋白质的影响。