真核細胞染色体複製開始の細胞周期による制御機構の研究

真核细胞染色体复制起始的细胞周期控制机制研究

基本信息

批准号：
04044114
负责人：
杉野明雄
金额：
$ 16.77万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for international Scientific Research
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至 1994
项目状态：
已结题

项目摘要

出芽酵母染色体DNA複製開始を細胞周期に依存して制御しているCdc7蛋白リン酸化酵素はそれ自体ではその活性を示さないが細胞周期によって特にG1/S期境界時に遺伝子発現が制御されているDbF4蛋白と複合体を形成することにより活性化される。一方Dbf4蛋白はある種の蛋白(おそらくは複製開始部位に特異的に結合しているORC複合体)を介して複製開始部位に特異的に結合することが本研究の分担者であるJ.Diffleyによって明らかにされた。従って染色体DNA複製開始時には、Cdc7-Dbf4複合体が複製開始部位に特異的に結合しているORC複合体を活性化すると同時にその他の複製開始に必要な蛋白(Mcm蛋白群及びCdc6蛋白など)と複製開始部位で大きな複合体を形成し複製を開始すると考えられる。このように複製開始制御に重要な働きをしているCdc7-Dbf4蛋白リン酸化酵素複合体は、また複製反応に必須はDNAポリメラーゼI(α)の触媒サブユニットである180-KDa蛋白及び-本鎖DNAに特異的に結合する蛋白RF-A複合体の70KDaと34KDaサブユニット蛋白を特異的にリン酸化することが明らかになった。特にこの内でこのリン酸化酵素によるリン酸化によってDNAポリメラーゼIの活性が制御することが明らかになった。また、Dbf4蛋白と相互作用していると考えられる新しい遺伝子を同定する目的で温度感受性変異dbf4-1を多コピーで抑圧する遺伝子を単離した。このうちMSD3と名付けた遺伝子は約分子量9万の蛋白をコードし、実際Dbf4蛋白と直接相互作用しており、DNA複製に必須であることが明らかになった。また、この新しい遺伝子産物は細胞周期M期を負に制御しているcheckpoint制御機構に必須であることも明らかになった。一方、染色体DNA複製に必須で、発現が細胞周期、特にG1/S期境界時に最大になる遺伝子の1つにDNAポリメラーゼII(ε)をコードするPOL2がある。この遺伝子の温度感受性突然変異株を多コピーで抑圧する遺伝子(multicopy suppressor)を単離した。この遺伝子(DPB11)はDNAポリメラーゼII(ε)のサブユニットと考えられるDpb11蛋白をコードしていることが明らかになった。このDpb11の温度感受性突然変異株を単離し、この株を非許容温度にすると、染色体DNA複製が非常に阻害された。一方、野生株では複製が完了しないと次の細胞周期過程M期に移行しない制御が働いているが、変異株では染色体DNA複製が完了していないにもかかわらず野生株のようにM期に入り、細胞分裂を起こすことが明らかになった。しかしその結果として染色体DNAの娘細胞への不均衡な分配が起こり急速な細胞生育率の低下が見られた。更にDNAポリメラーゼII(ε)のC-末端部分に変異を持つ株でもdpb11変異株と同様の表現型を示すことからDNAポリメラーゼII(ε)のみならずDpb11蛋白が染色体DNA複製に必須であると共に細胞周期のチェックポイントコントロール機構に直接関与していることを示すものであり、真核生物染色体DNA複製と細胞周期との非常に厳密で複雑なネットワークが存在することを示している。

Cdc7蛋白磷酸酶以细胞周期依赖性方式调节糖酵母染色体DNA复制的起始，并未自行显示其活性，而是通过与DBF4蛋白形成复合物来激活细胞周期，DBF4蛋白的基因表达受调节，尤其是在G1/S相边界处。另一方面，这项研究的作者J. Diffley透露，DBF4蛋白通过某种蛋白质特异性与复制起始位点结合（可能是特异性结合复制起始位点的兽人复合物）。因此，在开始复制染色体DNA后，人们认为CDC7-DBF4复合物激活了ORC复合物，该复合物专门与复制起始位点结合，同时，复制启动位点的大型复合物与复制开始所需的其他蛋白质开始（例如MCM蛋白质和CDC6蛋白质和CDC6蛋白质）的重复起点。因此，已经揭示了CDC7-DBF4蛋白磷酸酶复合酶在控制复制起始中起重要作用，特异性地磷酸化了180-KDA蛋白，DNA聚合酶I（α）的催化亚基，以及70KDA和34KDA和34KDA的蛋白质prot-prot-prots prots prots and Specters prots and Specters prots and Specters prots and prot-af-a DNA。特别是，已经表明，这种磷酸化酶通过这种磷酸化酶通过磷酸化来调节DNA聚合酶I的活性。此外，该基因抑制了抑制温度敏感的突变型DBF4-1用多个拷贝隔离的基因，以鉴定出与DBF4蛋白质相互作用的新基因。其中，名为MSD3的基因编码了一个分子量约为90,000的蛋白质，实际上直接与DBF4蛋白质相互作用，这清楚地表明它对于DNA复制至关重要。还揭示了该新基因产物对于检查点调节机制至关重要，该机制对细胞周期M相负面调节。另一方面，染色体DNA复制所必需的基因之一，其表达在细胞周期中最大化，尤其是在G1/s相边界处的表达，它是POL2，它编码DNA聚合酶II（ε）。分离了多拷贝抑制剂，该抑制剂用多个拷贝抑制了该基因的温度敏感突变体。已经揭示了该基因（DPB11）编码DPB11蛋白，该蛋白被认为是DNA聚合酶II（ε）的亚基。隔离DPB11温度敏感的突变体，并将应变带到非抗药性温度显着抑制染色体DNA的复制。另一方面，在野生菌株中，除非完成复制，否则有一个不会移动到下一个细胞周期过程M相的控制，但是已经发现，尽管染色体DNA复制尚未完成，但仍显示突变菌株像野生菌株一样进入M相，导致细胞分裂。但是，这导致染色体DNA在子细胞中的分布不平衡，导致细胞生长速率迅速下降。此外，在DNA聚合酶II（ε）的C末端部分中具有突变的菌株也表现出与DPB11突变菌株相似的表型，表明不仅DNA聚合酶II（ε）不仅是DNA聚合酶II（ε），而且DNA蛋白在伪装的互联网上的互联网既定性，并且与该络合的互联网相关，并且与该络合的互联点相关，并指示了该机能的既定性，这表明了该机能，并且与该机能相关，A ai涉及该机能，同位均与AI相关性。染色体DNA复制和细胞周期。