ヒト染色体DNA複製開始を制御している遺伝子の単離と解析

控制人类染色体DNA复制起始的基因的分离和分析

基本信息

批准号：
05152075
负责人：
杉野明雄
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05152075/
关键词：
染色体DNA複製開始 protein kinase 出芽酵母S.cerevisiae CDC7 DBF4 CDC7 homolog Northern hybridization 細胞周期

项目摘要

がん化の過程で重要と考えられる染色体DNA複製開始の調節に関する研究は殆ど進んでいない。その大きな理由の1つに高等動物細胞に於ける染色体DNA複製に関与する突然変異株がなかなか得られないところにある。一方単細胞であるが真核細胞の性質を備えている酵母は、遺伝学が非常に進んでいて、また容易に染色体DNA複製開始に関する突然変異株が得られる。また、最近の多くの研究から、生命にとって基本的な細胞周期、シグナル伝達やDNA複製の過程は酵母からヒト細胞に至るまで根本的に同じであることが明らかになりつつある。従って本研究は、酵母突然変異株を相補するヒト染色体DNA複製開始を制御している遺伝子の単離を試みた。出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)に於てG1からS期開始直前に必須な遺伝子としてセリン・スレオニン残基をリン酸化するprotein kinaseをコードしているCDC7が知られている。またCDC7 protein kinaseと複合体を形成し、protein kinaseを活性化しているDBF4遺伝子が知られている。そこでS.cerevisiae温度感受性突然変異株cdc7とdbf4を用いてヒト細胞よりCDC7とDBF4のhomologの単離を試みた。しかし残念ながらこの相補法では機能的に相同性のある遺伝子は現在まで得られていない。一方、CDC7 protein kinaseに特徴的なアミノ酸配列を基にして合成したoligonucleotidesをprimerを用いHeLa細胞より調整したmRNAをtemplateにしてPCR法によってDNA断片を増幅し、その塩基配列を決定した。この内の1つのDNA断片塩基配列より予想されるアミノ酸配列がS.cerevisiaeのCDC7のアミノ酸配列に非常に高い相同性を示した。従ってこの断片をprobeにして完全長のcDNAを単離した。このcDNAより予想されるアミノ酸配列はCDC7のアミノ酸配列と比較する全体で40%の相同性を示した。従ってこのcDNAはCDC7のヒトhomologをコードすると結論した。このcDNAをprobeにしたNorthern hybridization結果、予想通り、この遺伝子はG1とS期の間で発現していることが明らかになった。現在、この遺伝子産物に対する抗体を作製中であり、それを用いて今後この産物が本当にprotein kinaseであり、その活性がG1/S境界で上昇することを明らかにする予定である。

关于调节染色体DNA复制启动的调节很少的研究，这被认为在癌症过程中很重要。造成这种情况的主要原因之一是，很难获得较高动物细胞中染色体DNA复制的突变菌株。另一方面，单细胞但具有真核细胞的特性的酵母具有非常先进的遗传学，并且可以轻松获得与染色体DNA复制起始相关的突变体。同样，许多最近的研究表明，从酵母到人类细胞的基本细胞周期，信号传导和DNA复制过程从根本上都是相同的。因此，这项研究试图分离控制人类染色体DNA复制的启动的基因，以补充酵母突变菌株。在酿酒酵母中，Cdc7是已知的，它编码了蛋白激酶，该蛋白激酶将丝氨酸 - 硫代残基磷酸化是在S期开始之前从G1到S的开始。另外S.另外的DBF4基因，DBF4基因形成了与CDC7蛋白激酶的复合物，并与CDC7蛋白激酶蛋白蛋白蛋白蛋白酶相结合。因此，我们尝试使用酿酒酵母敏感的突变体CDC7和DBF4从人类细胞中分离CDC7和DBF4同源物。不幸的是，这种互补方法尚未获得功能同源基因。同时，使用底漆通过PCR扩增DNA片段，该引物是基于Cdc7蛋白激酶的氨基酸序列特征合成的，使用寡核苷酸，这些寡核苷酸是从HeLa细胞制备的，作为模板，并确定了碱基序列。这些DNA片段之一的基础序列预测的氨基酸序列与酿酒酵母中Cdc7的氨基酸序列的同源性很高。因此，该片段用作探针，以分离全长cDNA。与CDC7的氨基酸序列相比，该cDNA预测的氨基酸序列总体上显示了40％同源。因此，我们得出的结论是，该cDNA编码了人类的CDC7同源物。使用该cDNA作为探针的北部杂交结果表明，正如预期的那样，该基因在G1和S相之间表达。我们目前正在生产该基因产物的抗体，我们计划使用它来揭示该产品确实是一种蛋白激酶，其活性在G1/S边界处增加。