ユビキチンサイクルが支配するがん細胞の増殖と染色体不安定化

泛素循环控制的癌细胞增殖和染色体不稳定性

基本信息

批准号：
05151064
负责人：
瀬野悍二
金额：
$ 10.05万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

目的:がん細胞の特性である異常増殖を細胞周期の面で捉え、その制御に関わるユビキチンの代謝サイクルの役割を関連遺伝子の温度感受性変異株を用いて分子遺伝子、生化学の手法により明かにする。1.DNA複製および修復に関わるE2分子種の同定とクローン化を、非許容温度下、E1の変異に起因してユビキチンを受け取れなくなることを指標に、紫外線高感受性を示すE1変異株ts85、tsFT5、tsFS20について行った。2.E1の細胞周期上の発現はmRNA、蛋白質の両レベルで構成的であるが、細胞周期の各期に要求されるE1活性のレベルは各々異なるので、翻訳後修飾による活性調節としてリン酸化を検討した。E1上の特定位置のセリン残基が細胞周期M期に依存してリン酸化され、そのリン酸化はcdc2キナーゼによることをin vitro、in vivo両方で証明した。3.ts85は制限温度下G2期に停止するが、その際、核小体が異常形態を示すことを発見した。すなわち、核小体の中心部に間隙領域ができるが、電子顕微鏡観察によってこの間隙領域には均一サイズの粒子(直径約70nm)が星雲状に存在した。この粒子の実体を明かにすべく解析を進行中であるが、熱応答蛋白質HSP70の関与が蛍光免疫染色によって示唆された。また、G2期停止ts85細胞を許容温度に戻してM期まで進ませ、染色体をギムザ染色したところ、核小体の解離が不完全であることを示す染色体異常が認められ、銀染色、およびrDNAをプローブに用いたFISH及びセントロメア由来の反復配列DNAをプローブにしたFISHで核小体の異常に起因することを確認した。

目的：从细胞周期的角度了解癌细胞的异常增殖这一特征，并利用温度敏感突变株的分子遗传学和生化方法阐明泛素代谢周期在其控制中的作用。相关基因。 1.非允许温度下参与DNA复制和修复的E2分子的鉴定和克隆，以E1突变而无法接受泛素为指标，我们开发了具有高紫外线敏感性的E1突变株ts85和tsFT5。关注 tsFS20。 2.细胞周期期间E1的表达在mRNA和蛋白质水平上都是组成型的，但细胞周期的每个阶段所需的E1活性水平是不同的，因此磷酸化是通过翻译后修饰来调节活性所必需的。经过考虑的。我们在体外和体内证明了 E1 上特定位置的丝氨酸残基以细胞周期 M 期依赖性方式磷酸化，并且磷酸化是由 CDC2 激酶介导的。 3.我们发现ts85在限制温度下被阻滞在G2期，并且核仁表现出异常的形态。换句话说，在核仁的中心形成了一个间隙区域，电子显微镜显示该间隙区域中以星云的形式存在尺寸均匀的颗粒（直径约70 nm）。目前正在进行分析以澄清该颗粒的身份，荧光免疫染色表明热响应蛋白 HSP70 参与其中。此外，当G2期停滞的ts85细胞返回到允许的温度并允许其进展到M期时，染色体的吉姆萨染色显示染色体异常，表明核仁不完全解离，银染色和rDNA染色证实了这一点。使用使用探针作为探针的 FISH 和使用源自着丝粒的重复序列 DNA 作为探针的 FISH 来检测由核仁异常引起的结果。