ユビキチンサイクルが支配するがん細胞の増殖と染色体不安定化

泛素循环控制的癌细胞增殖和染色体不稳定性

基本信息

批准号：
04151062
负责人：
瀬野悍二
金额：
$ 9.28万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.マウスFM3A細胞より分離したユビキチン活性化酵素E1温度感受性変異株の変異点の決定:マウスE1の完全長cDNAをクローン化し、全塩基配列を決定した。11株のE1変異株について変異点をRNA-PCRによって決定したところ、(イ)全てcoding領域、しかもヒト、マウス、コムギ、出芽酵母間で共通アミノ酸である部位が変わっていた。また、(ロ)変異点はE1蛋白質のC末端側半分の領域に集中していた。2.変異E1とE2分子種との相互認識の変化の解析:S期進行に異常をもつE1変異株を用いてS期に必須な蛋白質のユビキチン化を仲介すると思われるE2分子種を、非許容温度におけるE1からE2への標識ユビキチンの転送反応の低下としてみつけた。そのクローン化が急がれる。3.E1酵素のリン酸化による活性調節の検討:E1mRNA量は細胞周期で変動が見られなかった。一方、大腸菌で発現したマウスE1はcdc2キナーゼによってin vitroでリン酸化され、活性は2倍以上に増加した。また、in vivoでE1のリン酸化を確認した。4.サイクリンのユビキチン化と細胞周期との関係:大腸菌で発現され精製したヒトサイクリンBのユビキチン結合を精製したE1とE2を用いて検討したが、明瞭な結合を確認できなかった。このことは、サイクリンBがcdc2キナーゼと結合状態のときのみユビキチン化される可件性を示す。5.姉妹染色分体交換(SCE)遺伝子の同定:CHO細胞から分離した高頻度SCE温度感受性変異株の変異を相補するヒト遺伝子をクローン化し構造決定したところ、RNAポリメラーゼIIのlargest subunitと同定された。その因果関係についての検討が急がれる。

1。测定从小鼠FM3A细胞分离的泛素激活酶E1温度敏感的突变体的突变点：克隆小鼠E1的全长cDNA，并确定整个碱基序列。当通过RNA-PCR确定11个E1突变体的突变点时（a）在所有编码区域之间以及人类，小鼠，小麦和发芽的酵母之间改变了常见氨基酸的位点。此外，（b）突变点集中在E1蛋白的C末端一半的区域中。 2。分析突变体E1和E2物种之间相互识别的变化：被认为使用具有异常S相进展的E1突变株在S期介导的E2物种被认为是在非腐烂温度下从E1到E2的泛素反应的降低。它的克隆很紧急。 3。通过E1酶的磷酸化检查活性的调节：在细胞周期中未观察到E1 mRNA量的变化。另一方面，在大肠杆菌中表达的小鼠E1在体外被Cdc2激酶磷酸化，其活性增加了两倍以上。另外，在体内证实了E1的磷酸化。 4。使用纯化的E1和E2研究了细胞周期蛋白泛素化与细胞周期之间的关系：在大肠杆菌中表达的人类细胞周期蛋白B的泛素结合，但尚未确认明确的结合。这表明仅当与Cdc2激酶结合时，细胞周期蛋白B被泛素化。 5。鉴定姐妹染色单体交换（SCE）基因：将从CHO细胞分离的高频SCE温度敏感突变体中的突变的人基因被克隆和结构化，并被鉴定为RNA聚合酶II的最大亚基。迫切考虑因果关系。