極微量DNAをクロ-ン化できるシャロミドベクタ-の開発と応用

可克隆极微量DNA的chalomid载体的开发及应用

基本信息

批准号：
01570259
负责人：
斎藤泉
金额：
$ 1.22万
依托单位：
国立予防衛生研究所
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

極微量のウイルスゲノム・cDNAのクロ-ン化を目的として、一連のシャロミドベクタ-(ラムダファ-ジベクタ-と同等のクロ-ン化効率を持ちながら、大きさや構造を自由に改変できるコスミドベクタ-)を作製した。まず一本の肝組織針生検から抽出したDNAの一部、わずか5マイクログラムからB型肝炎ウイルス(HBV)ゲノムの全長をクロ-ンできるシャロミドSを開発した。このベクタ-は制限酵素SalIをクロ-ン化部位に持ち、XhoIで直鎖状にしたHBVゲノムを選択的にクロ-ン化できる特徴を持っている。それにより肝炎患者針生検組織から、このウイルスがコ-ドする逆転写酵素を発現すると思われる新しいHBVRNAの同定に成功した。またさらにこのベクタ-に改良を加えたシャロミドSBを開発した。このベクタ-は、制限酵素SnaBIをクロ-ン化部位に持ち、平滑末端にしたほとんど全てのDNA断片を選択的に(すなわち、インサ-トを持った組換え体のみが大腸菌のコロニ-を作るように)クロ-ン化することができる。これを用いて、タイ国のHBV保因者の血清のわずか1m1からHBVゲノムの全長のクロ-ン化に成功した。この場合、クロ-ン化に用いたXhoIで直鎖状にしたHBVゲノムは再びXhoIを用いて切り出せる点が、シャロミドSよりも優れている。またこのシャロミドSBは、特にPCR法により増幅されたC型肝炎ウイルス(HCV)のcDNAのクロ-ン化にきわめて有用であることが示された。これらのベクタ-の使用法が確立されたことにより、微量のウイルス遺伝子のクロ-ン化がより容易に出来ることになった。

一系列Sharomide矢量（一系列的crums，等同于Lambdafa divector-（Lambdafa Jibector-，一种可以自由修改大小和结构的cosmide vector-出于少量病毒基因组和cDNA cDNA cDNA的目的 - 。首先，是从一个肝组织针头活检中提取的一部分DNA，这是一种可以用乙型肝炎病毒（HBV）基因组黑色的共享SHOMID S，仅从5微克。该矢量具有允许限制的酶Sali成为黑色的部分，并允许HBV基因组在XHOI中选择性黑链。这成功识别了一种新的HBVRNA，该HBVRNA似乎表达了病毒从肝炎患者和活检组织中逆转。此外，我们开发了Sharomide SB，该SB已改进了该向量。该矢量在Croiser的位置具有极限酶Snabi，并在光滑末端的末端选择几乎所有DNA片段（也就是说，只有具有Insatia的重组体是Escherichia coli的结肠。您可以（喜欢）。使用它，泰国HBV载体的血清中只有1 m1在HBV基因组的总长度上成功。在这种情况下，HBV基因组是一种用于黑对黑对的XHOI的链链，比Sharomid S更好，可以使用XHOI再次切出。还表明，Sharomide SB对于通过PCR方法扩增的cDNA（HCV）的cDNA特别有用。建立这些载体的使用使制作少量病毒基因变得更加容易。