アデノウイルスベクターを用いた目的蛋白の新しい大量産生法の開発

开发利用腺病毒载体大规模生产靶蛋白的新方法

• 批准号: 06670320
• 负责人: 斎藤 泉
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06670320/
• 关键词: ウイルスベクター; 遺伝子治療; リコンビナーゼ; Cre; HBs抗原; COS細胞; 複製起点

COS細胞とSV40の複製起点(ori)を併用した蛋白の大量発現系は広く研究室レベルで用いられているが、トランスフェクションによる遺伝子導入法では全細胞の10〜20%しか利用することができない。一方組換えアデノウイルスはCOS細胞を始めとして各種細胞へ高い遺伝子導入効率を示すが、直鎖状の遺伝子のため単独ではSV40系の正確な複製をおこす環状分子は生成しない。そこで組換えアデノウイルスと部位特異的リコンビナーゼCreを併用し、100%のCOS細胞へ複製可能な環状分子を導入する大量発現系(Ad-COS法)の確率を目的として研究を行った。Creは34bpのloxP配列を認識し、相同組換えに必要な一連の反応を単独で行うことが知られている。そこでSV40 oriと発現マーカーであるB型肝炎表面抗原(HBs)発現単位の両側にloxP配列をもつ組換えアデノウイルス(環状分子生成ウイルス)とCre発現組換えアデノウイルスを作成しCOS-1細胞へ同時感染した。その結果Creが発現することにより、環状分子生成ウイルス上のloxP配列で特異的な相同組換えを起こし、100%の細胞で設計どうりの環状分子が生成していたことがサザン法により明らかとなった。また生成した環状分子は3日目に最高500コピーにまで複製していた。Ad-COS法は、100%のCOS細胞へ複製可能な環状分子を導入する系であることが示されたので、従来のトランスフェクション法とAd-COS法での発現量をHBsのELISA法で測定し比較した。従来法は環状分子生成ウイルスと同じインサートを有するプラスミドをカルシウム法により遺伝子導入した。導入7日目までの発現蓄積量を比較したところAd-COS法では従来法の約5倍の発現量である8mg/リットルにまで達していることが示された。組換えアデノウイルスは神経や肝細胞等へも高い遺伝子導入効率を示すので、今後Ad-COS法とSV40T抗原発現組換えアデノウイルスを併用することで各種細胞における大量発現系の確立への発展性が示唆された。

使用COS细胞和SV40副本（ORI）的蛋白质表达大量，在实验室水平上使用，但在转染方法中只能使用所有细胞的10％至20％。另一方面，重组腺病毒对包括COS细胞在内的各种细胞具有很高的基因引入效率，但由于基因的基因而不会产生SV40系列的精确复制。因此，我们对使用重组腺病毒和部分重组酶CRE的概率进行了研究（AD-COS方法），以引入可以复制至100％COS细胞的圆形分子。已知CRE可以识别34bp LOXP序列，并单独进行同源重组所需的一系列反应。因此，具有LOXP序列（生成病毒生成病毒）和CRE表达重组腺病毒的重组腺病毒（圆形分子生产病）和表达标记物B型表面抗原（HBS）表达单位。结果，CRE揭示了南部定律是由LOXP序列在环分子产生病毒上产生的，导致特定的同源重组，并产生了由100％细胞设计的圆形分子。第三天将产生的圆形分子复制至500份。由于AD-COS方法是一种可以复制至100％COS细胞的圆形分子的系统，因此HBS ELISA方法是常规转染方法的表达和AD-COS方法。传统方法通过钙方法引入了与环状分子产生病毒相同的质粒。通过比较引入的第七天的表达积累，AD-COS方法表明它已达到8 mg/升，约为常规方法的5倍。由于将来通过使用AD-COS定律和SV40T抗原开发的腺病毒，重组腺病毒对神经和肝细胞等具有很高的基因引入效率，因此提出了各种细胞中质量发育的发展。

项目成果

S.Harada et al.: "Establishment of a cell line constitatively expressing E2 glyeoprotein of hepatitis C virus and humoral responce・・・" J.Gen.Virol.(in press). (1995)

S.Harada 等人：“建立表达丙型肝炎病毒 E2 糖蛋白的细胞系和体液反应……”J.Gen.Virol.（出版中）。

H.Chang et al.: "Highly efficient adenovirus-mediated gene transfer into renal cells in culture" Kiduey international. 47. 322-326 (1995)

H.Chang 等人：“高效腺病毒介导的基因转移至培养物中的肾细胞”Kiduey International。

H.Sakamoto et al.: "Adenovirus-mediated transfer of the HST-1(FGF4) gene induced incheased levels of platelet count in vivo" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 91. 12368-12372 (1994)

H.Sakamoto 等人：“腺病毒介导的 HST-1(FGF4) 基因转移导致体内血小板计数水平升高”Proc.Natl.Acad.Sci.USA。

Y.Nakamura et al.: "Adoptive immunotherapy with murine tumor-specific T lyphocytes engineered to secrete interleurin 2" Cancer Research. 54. 5757-5760 (1994)

Y.Nakamura 等人：“采用经过改造的小鼠肿瘤特异性 T 淋巴细胞进行过继免疫治疗，以分泌白细胞介素 2”癌症研究。

Y.Kanegae et al.: "A simple and efficient method for purification of infectious recombinant adenovins" Jpn.J.Med.Sci.Biol.47. 157-166 (1994)

Y.Kanegae 等人：“一种简单有效的纯化感染性重组腺病毒的方法”Jpn.J.Med.Sci.Biol.47。