クラミドモナスロドプシンの光受容-チャネル連関メカニズムの分子生理学的研究

衣藻视紫红质光感受器通道耦合机制的分子生理学研究

基本信息

批准号：
19045004
负责人：
八尾寛
金额：
$ 4.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

単細胞緑藻類の一種クラミドモナスにおいては、チャネルロドプシン1(ChR1)と2(ChR2)の2種類の古細菌型ロドプシンが光を感知し、走行性や驚光性などの行動を制御している。これらは、分子的に高い相同性を有しており、ともに光によりゲートされるチャネルを形成していると考えられているが、いくつかの性質において異なっている。性質の違いが、分子構造のどのような違いに依存しているのかを検討した。また、イオンチャネル機能に関連している構造を同定した。前年度の研究において、ChR1、ChR2の第5膜貫通領域に、両者を区別する構造が示唆された。そこで、両者において異なる8個のアミノ酸残基を一つずつ置換した変異体を作製した。これらのプラスミドベクターをHEK293細胞にトランスフェクションし、発現細胞をVenusの蛍光で同定し、ホールセルパッチクランプ下に光電流を計測した。(1)ChR2の第5膜貫通領域をChR1の相同セグメントに置き換えることにより、光電流の性質は、以下のように変化した : (1)活性化スペクトルの長波長域シフト、(2)脱感作の減少、(3)オン・オフキネティクスの緩徐化。すなわち、第5膜貫通領域にChR1とChR2の光電流の性質を区別する構造が示唆された。また、ChR2のAsn187をChR1の相同残基であるチロシン(Tyr)に置換することにより、上記と同様の変化が認められた。この変異は可逆的であった。すなわち、Tyr226(ChR1)/Asn187(ChR2)が両者を区別する決定基であることが示唆された。(2)クラミドモナスおよびボルボックスの4種類のチャネルロドプシンを前核動物のロドプシンと区別する構造が第2-3膜貫通領域にある。ここの5つのグルタミン酸残基を一つずつアラニンまたはグルタミンに置換したChR2の変異体を作製した。Glu97を変異したものでは、光電流コンダクタンスが大きく減少したが、それ以外の性質に影響は認められなかった。すなわち、Glu97がチャネルのイオン透過に関運していることが示唆された。

在衣藻（一种单细胞绿藻）中，有两种古菌视紫红质：视紫红质通道蛋白 1 (ChR1) 和 2 (ChR2)，可感知光线并控制行为，例如奔跑和惊吓。尽管它们具有高分子同源性并且被认为都形成光门控通道，但它们在几个特性上有所不同。我们研究了性质差异取决于什么样的分子结构差异。我们还确定了与离子通道功能相关的结构。去年进行的研究表明，ChR1 和 ChR2 的第五跨膜区有一个结构将它们区分开来。因此，我们创建了突变体，其中八个不同的氨基酸残基中的每一个都被一一取代。将这些质粒载体转染至HEK293细胞中，通过金星荧光鉴定表达细胞，并在全细胞膜片钳下测量光电流。 (1) 通过用 ChR1 的同源片段替换 ChR2 的第五个跨膜区域，光电流的特性发生如下变化：(1) 激活光谱的较长波长区域的移动，(2) 脱敏。减慢开关动力学。换句话说，在第五个跨膜区域中提出了一种区分 ChR1 和 ChR2 光电流特性的结构。另外，通过将ChR2的Asn187替换为ChR1的同源残基酪氨酸(Tyr)，观察到与上述相同的变化。这种突变是可逆的。换句话说，有人认为Tyr226(ChR1)/Asn187(ChR2)是区分两者的决定因素。 (2)第二和第三跨膜区有一个结构，将衣藻和团藻的四种通道视紫红质与原核生物的视紫红质区别开来。我们创建了 ChR2 突变体，其中五个谷氨酸残基中的每一个都被丙氨酸或谷氨酰胺取代。当Glu97突变时，光电流电导大大降低，但没有观察到其他影响。换句话说，表明Glu97参与离子通过通道的渗透。